Асд фракция 2 применение для кошек дозировка: АСД фракция 2 инструкция по применению, состав, показания, противопоказания, побочные эффекты – раствор для наружного, перорального, интравагинального и внутриматочного применения

Содержание

АСД фракция 2 инструкция по применению, состав, показания, противопоказания, побочные эффекты – раствор для наружного, перорального, интравагинального и внутриматочного применения

Внутрь препарат АСД фракция 2 назначают с питьевой водой перед кормлением или в смеси с комбикормом в утреннее кормление в дозах, указанных в таблице.

Вид животных, возрастКоличество препарата на голову (мл)Количество воды (мл) или корма (г)
Лошади
От 3 лет и старше10-20200-600
От 1 года до 3 лет10-15200-400
До 1 года5100
Коровы
От 3 лет и старше20-30200-400
От 1 года до 3 лет10-15100-400
До 1 года5-740-100
Овцы
Старше 1 года2-540-100
Старше 6 мес1-320-80
До 6 мес0.5-210-40
Свиньи
Старше 1 года5-10100-200
Старше 6 мес2-540-100
2-3 месяца1-320-80
Собаки
от 10 мес240
Куры, индюки, утки, гуси
Взрослое поголовье35100 л
Молодняк0.1 мл/кг

Наружно, внутриматочно и интравагинально препарат применяют в виде 2-20% растворов, приготовленных на стерильном физиологическом растворе. Для орального применения возможно приготовление на кипяченой воде.

При диспепсии, гастроэнтероколите, гастроэнтерите, а также дистрофических состояниях, вызванных расстройствами пищеварения и нарушениями обмена веществ, препарат назначают курсами по 5 дней с интервалами 2-3 дня внутрь 1 раз/сут в течение 1 мес.

При тимпании крупного рогатого скота

, при метеоризме кишечника у лошадей препарат выпаивают или вводят через зонд 1-2 раза/сут в течение 3-5 дней.

При катаральной пневмонии поросят наряду с этиотропным лечением препарат применяют 1 раз/сут за 30-40 мин до кормления с питьевой водой или в смеси с комбикормом. Препарат применяют курсами по 5 дней с интервалом 3 дня в течение 1 мес.

При вагинитах применяют 2 л 3-5% раствора препарата, подогретого до 37-40°С, которым промывают влагалище 1 раз/сут в течение 4-5 дней.

При задержании последа у коров (после его удаления) применяют 200-300 мл 3-5% раствора препарата, подогретого до 37-40°С, который вводят в полость матки 1 раз/сут в течение 4-5 дней.

При острых и хронических эндометритах, миометрите и пиометре у коров в полость матки вводят 200-300 мл 15% раствора препарата, подогретого до 37-40°С, и сразу удаляют, используя для этих целей катетер с обратным током жидкости, 1 раз/сут в течение 10-14 дней.

В комплексной терапии трихомоноза коровам вводят во влагалище 200-300 мл 20% раствора препарата при помощи шприца Жане 1 раз/сут в течение 10-14 дней.

При лечении быков, больных острой формой трихомоноза, препуциальный мешок промывают 1 л 2-3% раствора препарата, используя для этого кружку Эсмарха. После этого наружное отверстие препуциального мешка зажимают на 3-5 мин рукой и проводят легкий массаж. Процедуру повторяют 1 раз/сут в течение 5-7 дней.

В целях стимуляции центральной и вегетативной нервной системы, повышения резистентности у переболевших инфекционными и инвазионными болезнями животных, ускорения заживления кожных покровов, при некробактериозе, экземах, дерматитах, трофических язвах препарат применяют с питьевой водой или индивидуально в смеси с кормом 1 раз/сут курсами по 5 дней с интервалом 3 дня в течение 1 мес.

Инфицированные вялозаживающие раны промывают 15-20% раствором препарата, накладывают повязки, смоченные этим раствором. При наличии

свищей, вскрытых полостей абсцессов, флегмон в их полость вводят марлевый дренаж из этого раствора. Лечение проводят 1 раз/сут до образования грануляционного вала, но не более 10-14 дней.

При мыте лошадей и наличии абсцессов в подчелюстном пространстве и на других частях тела после предварительного туалета полости промывают 15-20% раствором препарата и при необходимости вводят тампоны, пропитанные лекарственным средством 1 раз/сут до очищения раны от гноя и появления грануляции, но не более 10-14 дней.

В целях стимуляции роста и развития телят, поросят и цыплят препарат применяют индивидуально в смеси с комбикормом из расчета 0.1 мл препарата АСД фракция 2 на 1 кг массы тела через день в течение 1-2 мес.

Особенностей действия при первом применении препарата и при его отмене не выявлено.

Следует избегать пропуска очередной дозы препарата, т.к. это может привести к снижению терапевтической эффективности. При пропуске одной или нескольких обработок курс применения необходимо возобновить в предусмотренных дозах и по той же схеме применения.

АСД 2 для кошек: применение, противопоказания

Если питомец заболел, нередко назначается АСД 2 для кошек. Препарат имеет богатый состав и улучшает обменные и пищеварительные процессы, препятствует прогрессированию воспалительных процессов. Хозяину животного следует знать механизм действия препарата, показания и противопоказания, а также учитывать возможные побочные эффекты.

Ветеринары относят АСД 2 фракцию для кошек к 3 классу опасности (умеренно токсический), что означает отсутствие негативного влияния на печень и иммунную систему животного.

Что в составе препарата?

Антисептический стимулятор Дорогова для котов представляет собой жидкость со специфическим резким запахом коричневато-желтоватого оттенка и содержит следующие компоненты:

  • продукты мясокостной муки;
  • холин;
  • пептиды;
  • холиновые эфиры карбоновых кислот;
  • амины, амиды и аммонийные соли;
  • соединения с сульфгидрильной (тиоловой) группой;
  • азотистые соединения;
  • вода очищенная.
Вернуться к оглавлению

Механизм действия

С помощью такого препарата можно наладить пищеварительную функцию у животного.

Препарат АСД 2 фракция для кота можно применять наружно и внутрь. При пероральном употреблении лекарство оказывает следующий лечебный эффект:

  • улучшает моторику пищеварительных органов;
  • положительно воздействует на вегетативную и центральную нервную систему;
  • стимулирует выработку секрета желез ЖКТ;
  • способствует всасыванию полезных веществ;
  • улучшает активность ферментов тканей;
  • стимулирует транспортировку ионов и питательных компонентов через мембраны клеток;
  • налаживает синтез белка;
  • способствует питанию тканей кожи;
  • повышает иммунитет;
  • нормализует обменные процессы.

При наружном применении АСД 2 фракции терапевтический эффект такой:

  • устраняет патогенную микрофлору;
  • снимает воспаление;
  • активизирует тканевые макрофаги;
  • ускоряет процесс регенерации.
Вернуться к оглавлению

Показания: когда назначается препарат?

Таким препаратом можно воспользоваться, когда у животного обнаружен лишай.

Коту АСД 2 фракцию ветеринары назначают при следующих нарушениях:

  • лишай;
  • ослабленный иммунитет;
  • перенесенные тяжелые инфекционные заболевания;
  • дисфункция ЦНС и вегетативной нервной системы;
  • дерматиты различной этиологии;
  • интоксикация при отравлении;
  • воспалительные процессы органов мочеполовой системы;
  • болезни носоглотки;
  • любые стадии рака и метастазирование;
  • нарушение метаболизма;
  • гастроэнтерит;
  • эндометрит, особенно при обильных выделениях из влагалища.
Вернуться к оглавлению

Применение: как правильно давать лекарство?

Котятам препарат назначается с осторожностью из-за маленького веса, поэтому дозировку должен рассчитать только ветеринар.

Важно придерживаться правильной дозировки препарата относительно веса питомца.

АСД 2 фракцию ветеринарный врач назначает индивидуально, исходя из состояния животного, этиологии заболевания, массы тела. Доза медикамента не должна превышать пропорции 2 кап./1 кг веса. Инструкция содержит следующие рекомендации:

  • профилактика — 1 кап./5 кг веса;
  • терапия — 3—4 кап./5 кг.

Медикамент дают кошке утром на протяжении 5 дней с перерывом на 2 или 3 дня. При раке прием начинается с 1 кап., ежедневно увеличивая до 20 кап., а после употреблять лекарство в обратном порядке — с 20 до 1 капли. Против лишая рекомендуется смочить ватный диск в препарате и приложить на проблемное место. А также при лишае можно использовать АСД 3 фракцию, которая предназначена только для наружного применения.

Вернуться к оглавлению

Противопоказания и побочные эффекты

Если применять медикамент по назначению ветеринара и строго придерживаться дозировки и рекомендаций инструкции, побочных проявлений не установлено. Может появиться индивидуальная аллергическая реакция на компоненты. При длительном приеме возможно сгущение крови, поэтому требуется постоянный лабораторный контроль показателей. Противопоказаний к АСД 2 фракции для кошек нет.

АСД 3 фракция, Армавир, 100 мл. Ветеринарная аптека HorseVet.

СОСТАВ И ФОРМА ВЫПУСКА

Препарат АСД–З является продуктом сухой перегонки сырья животного происхождения. Содержит в своем составе карбоновые кислоты, алифатические и циклические углеводороды, алкилбензолы и замещенные фенолы, алифатические амины и амиды, соединения с активной сульфгидрильной группой и воду. По внешнему виду препарат представляет собой густую жидкость от темно-коричневого до черного цвета, растворимую в спирте, растительных и животных маслах и практически не растворимую в воде. Выпускают препарат в форме стерильного раствора, расфасованного по 100 мл в стеклянные флаконы.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

АСД фракция 3 относится к тканевым препаратам. Получают путем сухой перегонки тканей животного происхождения. Препарат повышает иммунитет организма, обладает выраженным антисептическим действием, стимулирует активность ретикулоэндотелиальной и эндокринной систем, нормализует трофику, ускоряет регенерацию поврежденных тканей, не обладает кумулятивным действием. АСД фракция 3 по степени воздействия на организм относится к умеренно опасным веществам (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007).

ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ

Препарат АСД-З назначают животным наружно в нативном виде или в форме 20-50% масляных растворов. Применяется для лечения инфицированных вяло заживающих ран, дерматитов, хронических воспалительных повреждений кожи и копыт, трофических язв, свищей, копытной гнили овец и некробактериоза у животных, а также гинекологических заболеваний различной этиологии.

ДОЗЫ И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Масляные растворы готовят в асептических условиях с использованием стерильного касторового, льняного, подсолнечного масел или рыбьего жира при тщательном перемешивании с добавлением препарата АСД–З в соотношении 1:4 или 1:1.

При гинекологических заболеваниях АСД–3 применяют: при вагинитах интравагинально, а эндометритах — внутриматочно в виде 20-50% масляных растворов, при заболеваниях кожи и копыт — наружно в нативном виде или в форме масляных растворов и мазей.

Для лечения инфицированных вялозаживающих ран и свищей пораженный участок промывают 15-20% раствором другого препарата АСД–2 до прекращения гнойных выделений, а после этого накладывают марлевую салфетку с 20% масляным раствором препарата АСД–З, которую фиксируют бинтом. Лечение проводят до выздоровления, ежедневно заменяя салфетки с препаратом.

При экземах, пролежнях, дерматитах, хронических воспалительных поражениях кожи, пиодермии и трофических язвах на пораженные участки кожи наносят 25-50% масляные растворы препарата один раз в сутки, захватывая 2-3 см здоровой кожи с целью предупреждения распространения очага воспаления. Лечение проводят до выздоровления. При обширных поражениях препарат наносят попеременно на разные участки, покрывая за одну обработку не боле 1/10 поверхности тела животного.

При некробактериозе животных и копытной гнили овец после санитарной обработки пораженные участки смазывают нативным препаратом один раз в день до полного выздоровления животных. Лечение проводят в комплексе с местными хирургическими обработками и лекарственными средствами специфической и симптоматической терапии.

ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ

Применение АСД фракция 3 не исключает использование других лекарственных препаратов специфической и симптоматической терапии.

Продукция животноводства, полученная в период применения АСД фракция 3, может быть использована на общих основаниях. В случае вынужденного убоя животного, обработанные препаратом участки туши зачищают и утилизируют.

При работе с АСД фракция 3 следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными препаратами. По окончании работы руки следует вымыть теплой водой с мылом. При случайном контакте лекарственного препарата с кожей или слизистыми оболочками глаз, их необходимо промыть большим количеством воды. В случае появления аллергических реакций или при случайном попадании препарата в организм человека следует немедленно обратиться в медицинское учреждение (иметь при себе инструкцию по применению препарата и этикетку).

Пустые флаконы из под лекарственного препарата запрещается использовать для бытовых целей, они подлежат утилизации с бытовыми отходами. Неиспользованный лекарственный препарат утилизируют в соответствии с требованиями законодательства.

ПОБОЧНЫЕ ДЕЙСТВИЯ

Побочных явлений и осложнений при применении лекарственного препарата в соответствии с настоящей инструкцией, как правило, не наблюдается.

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ

Повышенная индивидуальная чувствительность животного к компонентам препарата (в том числе в анамнезе).

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ

Хранят АСД–3 в местах недоступных для детей, в упаковке предприятия-изготовителя отдельно от пищевых продуктов и кормов, в сухом, защищенном от света месте при температуре от 10 до 30°С. Препарат пригоден для применения в течение 4 лет с даты изготовления при соблюдении указанных условий хранения. После первого вскрытия флакона препарат пригоден к применению в течение 14 суток.

Производитель : Россия

ASD фракция 2 приложение для обучения собак. Применение АСД в ветеринарии

ASD Fraction 2 для собак — антисептик. Он используется для стимуляции двигательной активности желудочно-кишечного тракта и секреции пищеварительных желез. Кроме того, он незаменим для активации вегетативной нервной системы и центральной нервной системы. Повышает обмен веществ. Восстанавливает поврежденные ткани и оказывает противовоспалительное действие. Выпускается в виде жидкости со специфическим запахом.Фасовка от 10 до 100 мл.

Активные вещества

  • Карбоновые кислоты;
  • Производные алифатических аминов;
  • Углеводороды алифатические и циклические;
  • Соединения с активной сульфгидрильной группой.

ASD Fraction 2 для собак — инструкция по применению

Этот препарат уникален в своем роде, поскольку одновременно его действие распространяется на все уровни: вегетативную и центральную нервную систему, эндокринную и иммунную системы, а также периферические ткани. барьеры.

ASD 2: применение для собак и дозировка

Дозировка лекарства следующая:

  • Крупные собаки — 2 мл лекарства на 40 мл воды;
  • Щенки — уменьшенная доза в зависимости от веса.

Раствор принимают внутрь перед едой, запивая водой. Курс примерно 5 дней. Как дать собаке ASD 2 — лучше всего уточнить у ветеринара. Применяется как средство для промывания инфицированных и плохо заживающих ран.

Показания к применению (профилактика и лечение)

  • Болезни органов дыхания;
  • Болезни желудочно-кишечного тракта;
  • Заболевания мочеполовой системы;
  • Поражения кожи;
  • Дополнительная стимуляция деятельности вегетативной и центральной нервной систем;
  • Восстановление после инфекционных и инвазивных заболеваний;
  • Стимуляция роста;
  • Этот препарат также используется для лечения рака и уменьшения опухолей.

Противопоказания Побочные действия

Противопоказаний к применению препарата не выявлено. При соблюдении порядка применения и дозировки побочных эффектов нет.

АСД 2 для собак — отзывы


Станислав. Пудель страдал папилломой, которая формировалась на протяжении столетия. Она была довольно крупной и беспокоила собаку. Обратились к ветеринару за советом. Врач прописал закапать АСД в глаза. Результат не заставил себя ждать.В течение недели папиллома стала намного меньше. А через месяц он полностью исчез.


Естественно, мы очень довольны столь быстрым результатом, несмотря на то, что глаза собаки закапывались не каждый день. Отличное средство. Также он имеет очень широкую сферу влияния по различным проблемам. И, учитывая его быстрое действие в нашем случае, я думаю, что и при других проблемах ASD обеспечивает такое же эффективное лечение.

АСД 2 цена для собак

Препарат можно приобрести в любой ветеринарной аптеке по цене

Хранение препарата

АСД 2 для собак хранят при плюсовых температурах от 10 до 30 ° С в месте недоступен для прямых солнечных лучей и влаги.Закрытый препарат можно хранить 4 года, а открытый — две недели. По истечении срока годности использовать лекарство запрещено.

Состав:

Антисептический стимулятор Дорогова получают путем сухой перегонки трупов животных или продуктов, непригодных для употребления в пищу. Содержит продукты распада биохимических соединений, оказывающих на организм стимулирующее действие. Препарат выпускается в двух вариантах — ASD фракция 2 (f2), предназначенная в основном для приема внутрь, а также ASD-3 (f3), действующая наружно.

АСД-2

Выпускается в стеклянных флаконах объемом 20 или 100 мл. Это водорастворимая жидкость желтоватого, темно-красного цвета или промежуточных оттенков, имеющая неприятный запах. Возможно наличие черного осадка на дне бутылки.

фармакологическое действие

Препарат АСД-2 предназначен для обеспечения следующих способов воздействия на организм животных:

  • Стимуляция работы желез пищеварительного тракта.
  • Оптимизация осмотических процессов.
  • Повышение естественной сопротивляемости тела.
  • Нормализация питания тканей.
  • Ускорение восстановления работы пораженных эпителиальных оболочек.
  • Противовоспалительное и антисептическое действие.

Показания

Применяют животным в лечебных или профилактических целях при патологических состояниях следующих систем организма:

  • Пищеварительный тракт.
  • Органы дыхания.
  • Мочеполовая система.
  • Слизистые оболочки и кожа.
  • Нервная система.
  • Для стимуляции иммунной защиты после болезней.

Порядок применения

Согласно инструкции по применению, АСД-2 назначают животным растворенным в чистой воде или в составе кормовой смеси однократно утром. Разовая дозировка соответствует инструкциям в таблице.

Курс лечения в основном длится 5 дней.Затем следует 2-3-дневный профилактический перерыв, после которого лечебная процедура возобновляется. Лечение прекращается при достижении желаемого результата.

При необходимости наружного применения используйте 2–20% эссенцию, приготовленную в стерильных условиях. КРС Ф-2 назначают в следующих случаях:

  • Гастроэнтероколит.
  • Tympany. Лекарство вводится в полость рубца с помощью желудочного зонда. При этом массируют брюшную стенку и делают клизму.
  • Катаральная пневмония. АСД-2 показан как иммуностимулятор. Попросите выпить за полчаса до кормления или с концентратами.
  • Гинекологические заболевания:
  1. Вагинит. Влагалище коров промывают ежедневно 3-5% эссенцией F2 в количестве 2 дм 3, нагретой до 40 ° С. При открытой шейке матки целесообразно внутриматочно вводить 300 мл препарата.
  2. Отсроченный послед. Плацента удаляется, влагалище промывается, как при вагините.
  3. Эндометрит, пиометра.При открытой шейке матки 300 мл теплого препарата 15% концентрации заливают в матку с помощью специального катетера, обеспечивающего обратный ток жидкости.
  4. Трихомониаз. Для коров 20% насыщение АСД-2 применяют так же и в тех же количествах, что и при эндометрите, в качестве дополнительной лечебной процедуры. Быки заливают 1,0 л 3% -ной эссенции F2 в полость крайней плоти с помощью кружки Эсмарха. Выход зажимают на 5 минут, слегка массируют.

  • Для ускорения процесса регенерации при лечении экземы, некробактериоза, дерматита препарат применяют в дозировках, указанных в таблице.
  • В качестве стимулятора роста F2 рекомендуется кормить телят в составе концентрированной смеси в дозе 1,0 мл / 10,0 кг массы тела через день. Продолжительность лечения 30-60 дней.
  • Медленно заживающие гнойные раны независимо от вида животных промывают раствором препарата Ф2 20% концентрации. Затем накладывается пропитанная лекарством повязка. В свищи, открытые полости, подчелюстные лимфатические узлы лошадей, страдающих мытьем, вводят смоченную в рабочем растворе марлевую дренажную салфетку, накладывают асептическую повязку.Осушитель меняют ежедневно до появления грануляций.

АСД-2 широко применяется при лечении следующих заболеваний собак:

  • Пиодермия.
  • Злокачественные опухоли.
  • Глазные и респираторные инфекции.
  • Облысение.
  • Пищеварительные неинфекционные болезни — гастроэнтероколит.
  • Патологии мочеполовой системы.

При лечении болезней собак по инструкции применяют курсы продолжительностью 5-15 дней.После трехдневного отдыха лечебные процедуры возобновляются. Лечение онкологических заболеваний предполагает прием препарата АСД четыре раза в день.

Применяется для кожного лечения алопеции, дерматита грибковой или другой этиологии. Препарат применяют в концентрации 5–20%.

В птицеводстве F2 применяют групповым способом, в виде аэрозоля или с напитком, в следующих дозировках (таблица):

Препарат назначают по показаниям:

  • Суточные цыплята для формирования повышенного иммунитета.
  • Молодняк всех видов с аптериозом для стимуляции роста.
  • Для взрослой птицы для профилактики заболеваний пищеварительного тракта.
  • Молодняк и цыплята с инфекционным ларинготрахеитом, колисептицемией, микоплазмозом, инфекционным бронхитом.
  • Для кур-несушек для профилактики овариосальпингита, увеличения интенсивности яйценоскости.
  • Цыплята для более быстрого роста.

Побочные действия, противопоказания при применении препарата АСД 2 не установлены и не описаны.

Личная безопасность

Надевайте защитную одежду и резиновые перчатки. В инструкции по применению предусмотрено мытье рук и лица после работы с РАС. В случае попадания в глаза промыть их проточной водой. При возникновении аллергических явлений обратиться за неотложной помощью и приложить инструкцию по применению.

Условия хранения

Препарат хранят при комнатной температуре. Срок годности 4 года. После открытия его необходимо употребить в течение 14 дней. Контейнер отправляется на утилизацию как бытовые отходы.

ASD-3

Препарат имеет вид густой массы интенсивного коричневого цвета, неприятного запаха. Жидкость не растворяется водой. Содержит углеводороды, фенолы, азотсодержащие основания. Выпускается во флаконах по 50-200 мл из стеклянных или полиэтиленовых канистр объемом 1,0; 3.0; 5,0 л.

фармакологическое действие

Препарат F3 оказывает на организм следующие виды воздействия:

  • Активирует систему макрофагов.
  • Нормализует работу трофикы тканей.
  • Обладает антисептическим и противовоспалительным действием.

Для лечения использовать оригинальный препарат или его масляные растворы 20-50% концентрации, приготовленные по инструкции в антисептических условиях.

Показания к применению

АСД-3 применяется для лечения следующих болезней животных:

  • Некробациллез крупного рогатого скота, копытная гниль коз и овец. После очистки пораженного участка от омертвевших тканей и гноя исходная жидкость наносится ежедневно до устранения дефекта.Продолжительность лечения не должна превышать 28 дней.
  • Поражения кожи. Используйте масляную эссенцию препарата АСД 20-50% концентрации до выздоровления. При поражении обширных поверхностей за один прием обрабатывается не более 10% тела.
  • Лечение плохо заживающих ран. Первичное лечение проводится промыванием дефекта раствором препарата Ф2 20% концентрации до исчезновения гнойного отделяемого. На подготовленную поверхность накладывается салфетка, пропитанная 20% эссенцией F3.Лечение не должно длиться более 3 недель.
  • Трофические язвы, пролежни. На патологические участки наносят масляный раствор препарата Ф3 25-50%. Захватите 2-3 см непораженной кожи.
  • Гинекологические заболевания. При эндометрите внутриматочно вводят около 300 мл 25-50% масляного раствора препарата. При развитии вагинита во влагалище вливают такое же количество лекарства.

Применение АСД-3 не мешает проведению хирургического лечения.

Побочные эффекты

При превышении допустимого объема исходного ASD-3 может развиться раздражение кожи. Слой препарата удаляют марлевым тампоном, а воспаленный участок обильно промывают водой не менее трех раз.

Ограничения

Активные ингредиенты ASD не выделяются с молоком или яйцами. В случае вынужденного убоя обрабатываемые препаратом места и окружающие ткани очищаются и утилизируются.

Персональная безопасность

Меры безопасности такие же, как при использовании ASD-2.

Препараты АСД-2 и АСД-3 разрабатывались достаточно давно; тем не менее, их новые лечебные свойства постоянно открываются.

Антисептический стимулятор Дорогова многие специалисты называют друг друга «эликсиром жизни». АСД 2 для собак выпускает Армавирская биофармацевтическая компания. Препарат эффективен при лечении новообразований, бурситов и полипов у взрослых собак. Он также используется как антисептик и средство, ускоряющее регенерацию тканей.


Фракция ASD 2 для собак выпускается в виде коричневатой или желтоватой жидкости. Расфасовка в стеклянные флаконы по 100 и 20 мл. Жидкость имеет неприятный специфический запах. Лекарство изготавливается из костей и мягких тканей животного происхождения, переданных до мельчайшей фракции.

В состав входят:

  • кислота карбоновая;
  • углеводородов;
  • производные сульфгидрильных веществ;
  • алифатических аминов.

Инструкция по применению АСД 2 для собак

Мельчайшие молекулы веществ в составе препарата легко проникают в любые ткани тела собаки и способствуют их быстрому выздоровлению.

Препарат назначают при патологиях:

  1. При различных опухолях у щенков и взрослых собак: саркома, лимфома.
  2. Для кожных инфекций, дерматитов и экзем.
  3. Нарушения иммунной системы.
  4. При желудочно-кишечных расстройствах после вирусного заболевания: энтерита, чумы или тяжелой интоксикации.
  5. Болезни верхних и нижних дыхательных путей.
  6. Воспаление мочеполовой системы: цистит, вульвовагенит, эндометрит.
  7. При истощении нервной системы.
  8. Для лечения вирусных и бактериальных инфекций ушей и глаз у животных.

Для лечения применяют:

  • местно: примочки и компрессы с раствором или каплями;
  • перорально: использовать в виде водного раствора.

Владельцы спрашивают, как давать раствор для перорального применения и давать его своему питомцу. Перорально препарат вводят в рот животного с помощью шприца без иглы:

  1. Готовят раствор препарата в соотношении 1 мл АСД / 20 мл кипяченой воды комнатной температуры.В некоторых случаях дозировка увеличивается вдвое. Состав зависит от вида заболевания.
  2. В шприц на 10 или 5 мл набирают раствор препарата с водой.
  3. Животному открывают пасть и вводят жидкость в корень языка. Важно быстро влить продукт и закрыть животному пасть.
  4. Собака запрокинула голову и похлопала по горлу.

Препарат желательно давать собаке утром за 15 минут до еды.

Дозировка

Как принимать ASD 2 для собак, зависит от размера собаки и цели.

Дозировка для внутреннего применения:

  • Для собак от 1 до 5 кг по 0,5 мл.
  • Собаки от 5 кг по 1 мл в сутки.
  • Щенкам от 6 месяцев дозировка уменьшается в зависимости от веса.

Курс лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и ЛОР-органов составляет 5 дней, затем делается перерыв на 2 дня.В онкологии препарат назначают каждые 4 часа в течение 5 дней. Щенкам для поддержания иммунитета назначают АСД 2 через день.

Дозировка для наружного применения:

  1. В случае поражения кожи: 5 мл ASD разбавляют 95 мл теплой воды или физиологического раствора. В составе смачивается марлевая повязка, которую накладывают компромиссом на пораженный участок. Компресс фиксируется на теле животного более суток.
  2. При гнойных ранах: 20 мл ASD 2 смешивают с 20 мл воды или физиологического раствора.Средство смачивает марлевый тампон, который кладут в рану.
  3. При поражении глаз и ушей: 5 мл АСД на 100 мл воды. Закапывают по 2-3 капли в каждый глаз или ухо 2 раза в день. Продолжительность курса — неделя.
  4. При облысении водный раствор втирают в кожу животного 1 раз в сутки в течение 7 дней.

Достоинства и недостатки

Достоинства:

  • натуральный состав;
  • наличие в каждой ветеринарной аптеке любого города;
  • низкая стоимость;
  • отлично сочетается с любыми лекарствами и народными средствами;
  • не имеет побочных эффектов.

Недостатки:

  • специфический и неприятный запах, быстро разносящийся по квартире;
  • трудно заставить собаку проглотить препарат;
  • эффективность наблюдается только при правильном и регулярном использовании;
  • сложно рассчитать дозировку для щенка менее 1 кг.

Противопоказания

Фракция ASD 2 противопоказана следующим собакам:

  • пожилых животных с проблемами свертывания крови;
  • щенков до 6 месяцев.

Всем остальным животным препараты на основе натуральных компонентов не противопоказаны.

Побочные эффекты

10% имели побочные эффекты ASD 2 для собак:

  • тошнота и неприязнь из-за неприятного запаха;
  • повышенная свертываемость крови.

Тромбофлебит наблюдался только у пожилых животных, старше 7 лет и при длительном применении. Других побочных эффектов фракция не вызывает.

> ASD-2 (раствор)

Информация на этой странице носит ознакомительный характер и не может быть использована для самолечения!
Перед применением препарата ОБЯЗАТЕЛЬНО проконсультируйтесь со специалистом!

Краткое описание: АСД-2 — препарат, полученный путем перегонки сырья животного происхождения.Он содержит активные вещества, которые стимулируют работу центральной и вегетативной нервной системы животного, улучшают моторику желудочно-кишечного тракта, способствуют нормализации пищеварения и повышают устойчивость организма животного к воздействию патогенных микроорганизмов. При наружном применении препарат проявляет активные противовоспалительные и антисептические свойства, улучшает заживление поврежденных тканей. Лекарство используется для лечения, а также для профилактики различных заболеваний: органов дыхания (катаральная пневмония), желудочно-кишечного тракта (диспепсия, метеоризм, гастроэнтерит, тимпанит), мочеполовой системы (вагинит, задержка плаценты, эндометрит, миометрит, пиометрит, трихомониаз).Препарат эффективен при нарушении обмена веществ, ослаблении иммунной системы, а также для лечения ран и абсцессов.

Для кого: АСД-2 применяется для лечения коров, быков, овец, коз, лошадей, свиней, птицы, собак. Это лекарство часто назначают для стимуляции роста молодняка (поросят, цыплят, телят) и увеличения яйценоскости цыплят.

Отпускная форма: Препарат представляет собой жидкость стерильную, хорошо смешивается с водой, цвет может варьироваться от желтого до темно-красного, допускается наличие черного мелкодисперсного осадка.Выпускается раствор в стеклянных флаконах емкостью 20 или 100 мл.

Дозировка: Препарат при пероральном применении назначают животным, смешивая с питьевой водой или комбикормом один раз в сутки утром. Точная дозировка и продолжительность использования определяется ветеринаром индивидуально. Наружно АСД-2 применяется в виде раствора (концентрация от 2 до 20 процентов), который готовят на стерильном физиологическом растворе или кипяченой воде в асептических условиях.

Ограничения: при соблюдении схемы лечения, назначенной специалистом, побочных эффектов не наблюдается.Противопоказаний к применению данного лекарственного средства нет. Молоко кормящих самок, яйца и мясо после применения препарата можно употреблять без ограничений. После вскрытия флакона лекарство годно к применению в течение 14 дней. При работе с раствором следует использовать резиновые перчатки; пустые флаконы из-под препарата для бытовых целей использовать не следует.

Отзывы о «Фракция АСД-2 (раствор) для собак и кошек»:

у 3-летнего кота, истощения и обезвоживания весит меньше килограмма, он сам не может съесть как рассчитать в каплях

Ответить [x] Отменить ответ

Я слышал, что после войны раненые и больные, которых лечили АСД-2, живут долго

Ответить [x] Отменить ответ

А мы с тесть сами, с перерывом в игре в год пьем по схеме ASD 2

Ответить [x] Отменить ответ

У кошки папилломы в ушах, течет гной, вокруг ушей язвы.Подскажите, может, фракцией РАС удастся вылечить, коту 11 лет и весит 15 кг.

Ответить [x] Отменить ответ

У нас есть ротвейлер, 6,5 лет (молодой) 54 кг. Остеосаркома, купила этот препарат, попробуем, а вдруг поможет, рак конечно не вылечит, но хотя бы продлить жизнь моему питомцу может, проблема в том, что мы не в России, и нет малейший шанс проконсультироваться с ветеринаром, буду надеяться на лучшее

Ответить [x] Отменить ответ

Конечно, попробуйте! А людям с онкологией помогает животным, если им не очень пренебрегать.А если пренебречь, то облегчит состояние, т.к. ASD также обладает обезболивающим действием. Давайте дважды в день, всегда запивая охлажденной кипяченой водой, желательно за час до еды. Налейте из большого шприца без иглы по щеке вниз, чтобы на язык не сразу попалась глотка из другого шприца — некрепкого ромашкового чая или просто воды. И нужно следить за тем, чтобы в поилке всегда была свежая вода — это важно!

Ответить [x] Отменить ответ

Ответить [x] Отменить ответ

При плохом аппетите у коз, в том числе при переедании, в первую очередь.У кошки внутри вызывает сильную рвоту

Ответить [x] Отменить ответ

Собака заболела, лечилась в поликлинике, но собака не ела сама 2 недели, рвота. Как я могу помочь своей собаке с помощью стимулятора ASD2, весить 20 кг, а теперь 11! Справка

Ответить [x] Отменить ответ

Моя собака тоже овал съела, это просто кошмар, сегодня мы были у врача, он прописал лекарство, но весит он около 8-10 кг, o6 сказал пить по схеме 1 день -1 капля
2 день -2 капли
3 дня — 3 капли
4 день-4 капли
5 день -5 капель
6-дневный отдых
7 день -4 капли
8 день -3 капли
9 день — 2 капли
10 день -1 капля
Капли развести в воде, взять шприц на 5 стаканов, набрать 5 кубиков воды и смешать с ____ каплей…
Откройте рот и налейте …
Попробуйте, может вам помочь …

Ответить [x] Отменить ответ

7 лет назад у кошки отобрали задние лапы. коту тогда было 9 лет. В течение 5 дней ASD давал ему воду — разбавлял и с помощью шприца заливал в рот. Ожил! все еще жив и здоров. Коту сейчас 16 лет

Ответить [x] Отменить ответ

Антон, я хочу попробовать использовать ASD для лечения молодых голубей. Подскажите, пожалуйста, в какой пропорции разводить в поилке?

Ответить [x] Отменить ответ

Уже давно мы активно используем этот инструмент в домашнем хозяйстве.Мы используем его не только для лечения, но и для профилактики. Благодаря использованию препарата в качестве иммуностимулятора удалось добиться почти стопроцентной выживаемости кур. Я получил этот процент, ежедневно добавляя раствор в воду пятидневным цыплятам. Кроме того, ASD-2 использовался в смеси с другими агентами для лечения различных инфекций у птиц, мелких жвачных животных и кроликов. Препарат можно использовать как антисептик, он отлично справляется с открытыми ранами или нагноениями.А познакомиться с этим прекрасным средством мне пришлось около полутора лет назад. Когда я впервые переехал в деревню, у меня еще не было должного опыта в животноводстве. И по ошибке добавил пшеничные отруби в телячье молоко. Ветеринар сказал, что у теленка сильный запор, и прописал ему лекарства. Я перепробовала все, что прописал ветеринар, но желаемого результата так и не добилась, а на четвертый день теленок вообще перестал двигаться. Затем я перезвонил ветеринару, и он посоветовал мне ASD-2, выразив удивление, что он вообще мог забыть об этом лекарстве.Благодаря этому лекарству на следующий день после применения животное успешно справилось со своей задачей, а еще через пару дней полностью выздоровело.

Ответить [x] Отменить ответ

У меня есть немецкая овчарка, кобель.
Четыре месяца назад он схватился с соседским доберманом. В результате на задней лапе рвется мягкая ткань. Наложены швы. Заживление шло медленно, кровь постоянно сочилась, потому что лапа всегда была в движении. Собака все время лизала, рану ковыряла, хотя они были в ошейнике.
Образовалась трофическая язва приличных размеров и глубиной около 2 см. Ветеринар несколько раз прижигал, прописывал антибиотики, левомеколь, но с каждым днем ​​становилось все хуже.
Я нашел похожую ситуацию на форуме любителей собак и прочитал про ASD-2. Очевидно, купили в ветеринарной аптеке.
Начали промывать язву и делать компрессы 10% раствором АСД-2. Также давали по 3-4 капли в день во время еды.
Язва стала заметно подсыхать примерно через неделю.Мы продолжили лечение, отменив все остальные лекарства. Собака заметно оживилась и перестала ныть.
В течение месяца на месте язвы появилась новая кожа, затем стали появляться волоски шерсти. То есть благодаря АСД-2 мы собаку не потеряли.
Кстати, заметил, что у собаки исчезла перхоть, что было постоянной проблемой.

Ответить [x] Отменить ответ

В моей семье раствор ASD-2 зарекомендовал себя как отличный антисептик.На ферме живут собака и несколько кошек, лечение которых раньше требовало больших усилий и дорогих лекарств. При первом испытании АСД-2 на беспородной собаке, у которой развился демодекоз около глаза, он очень активно прогрессировал. В ветеринарной клинике врач посоветовал приготовить мазь на основе раствора АСД-2. Препарат начал действовать буквально через несколько дней после первого применения: у собаки уменьшилась площадь поражения с демодекозом, купировалось воспаление, спал отек века.После двух недель использования собака была практически здоровой, но процессы восстановления кожи и шерсти продолжались. Для профилактики использовали АСД-2 еще несколько дней.
Прошлым летом кот получил травму лапы в драке с другими кошками, которую я видел через несколько дней, когда он вернулся домой, так что рана была запущена — началось воспаление. Врач посоветовал использовать уже известный мне препарат АСД-2. На этот раз препарат принимали внутрь по несколько миллилитров, запивая питьем (молоко, бульон).Естественно также наблюдались стерильность раны и ее очищение. На шестой день применения препарата воспаление стало спадать и начался процесс заживления. Полное восстановление тканей и шерсти кошки произошло за два месяца. Мы также использовали АСД-2 при лечении открытых ран и нагноений в качестве антисептика (в случае гнойных ран, на мой взгляд, очень хорошие результаты дает очищенная смола, смешанная с небольшим количеством АСД-2, но здесь главное не переборщить, ведь среда получается достаточно щелочной).В итоге хочу сказать, что это средство для меня лично настоящая находка, и я считаю, что оно должно быть в кабинете ветеринарной медицины каждого животновода.

Ответить [x] Отменить ответ


Facebook

Твиттер

В контакте с

Google+

Бизнес с нуля

Использование внутривенной липидной терапии у кошек с передозировкой карпрофена

Clin Case Rep.2020 Apr; 8 (4): 653–657.

, 1 , 1 , 1 и 2

Натан С. Чамблер

1 Колледж ветеринарной медицины Университета Теннесси, Ноксвилл TN, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,

Джули К. Шильдт

1 Колледж ветеринарной медицины Университета Теннесси, Ноксвилл TN, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,

Дайан И. Моуби

1 Колледж ветеринарной медицины Университета Теннесси, Ноксвилл TN, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,

Марк Г.Папич

2 Колледж ветеринарной медицины Университета штата Северная Каролина, Роли NC, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,

1 Колледж ветеринарной медицины Университета Теннесси, Ноксвилл TN, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,

2 Колледж ветеринарной медицины Университета штата Северная Каролина, Роли NC, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,

Автор, ответственный за переписку. * Переписка
Натан С. Чамблер, Колледж ветеринарной медицины Университета Теннесси, 2407 River Drive, Ноксвилл, TN 37996, США.
Электронная почта: [email protected],

Поступила в редакцию 18 июля 2019 г .; Пересмотрено 8 декабря 2019 г .; Принято 18 декабря 2019 г.

Copyright © 2020 Авторы. Отчеты о клинических случаях , опубликованные John Wiley & Sons Ltd. , при условии правильного цитирования оригинальной работы. Эта статья цитировалась в других статьях в PMC.

Abstract

Внутривенная липидная эмульсия (ILE) была введена кошке без побочных эффектов.В этом клиническом случае постулируется, что ИВС можно использовать для лечения токсичности карпрофена у кошек, и подтверждается теория поглощения липидов как основного механизма действия.

Ключевые слова: кошачий токсикоз, внутривенные липиды, передозировка НПВП

Abstract

Внутривенная липидная эмульсия (ИЛЭ) была введена кошке без побочных эффектов. В этом клиническом случае постулируется, что ИВС можно использовать для лечения токсичности карпрофена у кошек, и подтверждается теория поглощения липидов как основного механизма действия.

1. ВВЕДЕНИЕ

12-летний мужчина с кастрированными короткими домашними волосами принял около 12 мг / кг карпрофена. Его лечили активированным углем, внутривенной липидной эмульсией (ILE) и общей поддерживающей терапией. Концентрации сыворотки, измеренные до ИВС, а также через 1, 3 и 6 часов после лечения ИВС, показали повышение концентрации карпрофена в сыворотке. Пациент полностью выздоровел.

Нестероидный противовоспалительный (НПВП) токсикоз — одно из наиболее частых отравлений у мелких животных.1 Карпрофен — популярный НПВП, назначаемый собакам. Подобно другим НПВП, он подавляет выработку циклооксигеназы, которая, в свою очередь, снижает синтез простагландинов. 2 Этот механизм объясняет терапевтический эффект препарата, заключающийся в уменьшении боли и воспаления. Однако снижение простагландинов может привести к побочным эффектам, включая раздражение желудка, повреждение печени и почек, а также увеличение времени кровотечения за счет предотвращения агрегации тромбоцитов.

Выведение карпрофена происходит в основном путем биотрансформации в метаболиты глюкуронида в печени.3 У кошек снижена активность фермента глюкуронизации, что снижает их способность метаболизировать карпрофен. Период полувыведения у кошек составляет примерно 18-20 часов, 4, 5, 6, тогда как период полувыведения у собак составляет примерно 8-12 часов.4, 7

Карпрофен одобрен для использования у кошек в Европе, Австралии и Новой Зеландии в дозе 4 мг / кг подкожно / внутривенно в качестве одноразового периоперационного анальгетика. Такое дозирование обычно приводит к продолжительности действия от 18 до 24 часов при внутривенном или подкожном введении5; однако исследований, посвященных динамике и кинетике перорального приема у кошек, недостаточно.2 Центр по борьбе с отравлениями животных ASPCA сообщил о токсикозе при дозах всего 2,9 мг / кг для кошек (Краткое описание токсикологии — Volmer, P & MenschingD — Управление острым токсикозом карпрофена у собак и кошек — 2009; http: // veterinarymedicine .dvm360.com / токсикология-краткое управление-острым-карпрофен-токсикозом-собаками-кошками). В одном отчете о случае показана перфорация двенадцатиперстной кишки у кошки, получавшей карпрофен в дозе 2,2 мг / кг перорально каждые 12 часов в течение неуказанного периода времени.8 Хотя этот пациент также получал дексаметазон и флуниксин меглумин, их вводили после появления клинических признаков; следовательно, их введение не считалось причиной перфорации двенадцатиперстной кишки.Напротив, исследование безопасности показало отсутствие побочных эффектов у 7 здоровых кошек, которым вводили подкожно карпрофен в дозе 4 мг / кг один раз в день.

Лечение передозировки НПВП обычно состоит из деконтаминации желудочно-кишечного тракта (GID) с использованием комбинации рвоты и активированного угля (AC) .9, 10 Доказано, что эти методы деконтаминации вызывают снижение концентрации карпрофена в плазме крови. 10 Внутривенная липидная эмульсия (ILE) ) также используется для лечения токсикоза НПВП у собак. Собака с токсикозом ибупрофена11 и три собаки с токсикозом напроксен12 успешно лечились ИЛЭ в сочетании с РГИ.Поскольку карпрофен имеет аналогичный механизм действия и химические свойства, аналогичные другим НПВП, лечение токсикоза с помощью ИВС должно быть столь же успешным. Насколько известно автору, это первое сообщение об использовании ИЛЭ у кошек с передозировкой НПВП.

2. РЕЗЮМЕ ДЕЙСТВИЯ

12-летний кастрированный мужчина с короткими домашними волосами весом 6,3 кг поступил по поводу повышенной вокализации при попытке помочиться и явных спазмов уретры; однако по дороге в больницу он помочился.Диагностическое тестирование, включая панель биохимии сыворотки и УЗИ органов брюшной / грудной полости, не выявило примечаний (таблица). Ему поставили предположительный диагноз заболевания нижних мочевых путей у кошек и выписали празозин (капсулы празозина гидрохлорида 1 мг, Mylan Pharmaceuticals Inc) (0,04 мг / кг перорально каждые 8 ​​часов) и бупренорфин (Buprenex ® , Reckitt Benckiser Healthcare (Великобритания). ) Ltd.) (0,02 мг / кг сублингвально каждые 8 ​​часов). На следующее утро дома он случайно получил таблетку 75 мг карпрофена (Римадил ® ) (~ 12 мг / кг) и немедленно вернулся для оценки.

Таблица 1

Соответствующие лабораторные значения при поступлении, через 24 часа после приема карпрофена и в течение всей госпитализации

День 4 День 4 5
Лабораторные значения Первоначальная презентация 24 часа День 2 День 3 День 4 Референтный интервал
АМК, ммоль / л (мг / дл) 8,9 (25) 12,5 (35) 9,6 (27) 10,4 (29) 13.6 (38) 31 (11,1) 6,4-14,3 (18-40)
Creat, мкмоль / л (мг / дл) 133 (1,5) 318 (3,6) 212 ( 2,4) 195 (2,2) 195 (2,2) 159 (1,8) 79,6-176,8 (0,9-2,0)
Ca, ммоль / л (мг / дл) 2,4 (9,6) 2,0 (8,1) 2,2 (8,6) 2,2 (8,7) 2,2 (8,9) 2,2 (8,7) 2,2-2,7 (9,0-10,8)
Фос, ммоль / л ( мг / дл) 1.16 (3,6) 2,91 (9,0) 1,26 (3,9) 1,23 (3,8) 1,58 (4,9) 1,58 (4,9) 0,7-1,7 (2,2-5,3)
Na, ммоль / л (мэкв / л) 156 (156) 160 (160) 156 (156) 156 (156) 149 (149) 152 (152) 145-154
K, ммоль / л (мг / дл) 3,6 (3,6) 3,4 (3,4) 3,3 (3,3) 3,5 (3,5) 3.0 (3,0) 3,1 (3,1) 2,5-4,6
Cl, ммоль / л (мэкв / л) 117 (117) 122 (122) 116 (116) 114 (114) 111 (111) 113 (113) 114-124
ALT, U / L (единицы / л) 77 133 29-109
PCV,% 39 40 30 30 34-48
г / г ) 76 (7.6) 78 (7,8) 64 (6,4) 61 (6,1) 66-84 (6,6-8,4)

Пациент при поступлении выглядел бодрым, настороженным , и отзывчивый. Ректальная температура, частота сердечных сокращений и частота дыхания были в пределах нормы. Общий физический осмотр без особенностей, небольшой мочевой пузырь был оценен при пальпации живота. Учитывая, что время, прошедшее с момента приема внутрь, составляло примерно 1 час, начальная терапия была сосредоточена вокруг РГИ.Вызвание рвоты гидроморфоном (HydromorphoneHCl Injection, USP (2 мг / мл), West-Ward,) (0,1 мг / кг внутримышечно) и дексмедетомидином (Dexdomitor ® ) (0,002 мг / кг внутримышечно) было безуспешным. Кошка была госпитализирована для продолжения дезактивации и поддерживающего ухода, который включал однократную дозу AC с сорбитолом (Toxiban ® Suspension w / Sorbitol, Lloyd, Inc) (2 г / кг), вводимую через назогастральный зонд (Mila Weighted Nasogastric Feeding Tube 5Fr. X55 см, MILA International Inc.). Был установлен внутривенный катетер (20 gIVCatheter1 ′ ′ / 25 мм), и пациент получил 20% интралипид (Intralipid ® 20%, Baxter Healthcare) (1.5 мл / кг в течение 15 минут, а затем 0,25 мл / кг / мин в течение 1 часа). Не было отмечено никаких побочных эффектов, за исключением макрогенной липемии. Кровь для измерения концентрации карпрофена брали непосредственно перед введением ИВС, а затем через 1, 3 и 6 часов после ИВС. Сыворотку отделяли, замораживали и хранили при -80 ° C для анализа с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (система Agilent серии 1200 Gradient HPLC, Agilent Technologies). До начала ИЛЭ концентрация карпрофена в плазме составляла 8 мкг / мл. Концентрация после ИВС увеличилась до 31.4 и 31,7 мкг / мл через 1 и 3 часа, соответственно, но снизились до 26,69 мкг / мл через 6 часов после введения (таблица).

Таблица 2

Концентрации карпрофена в сыворотке, измеренные с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии до и через 1, 3 и 6 ч после ИЛЭ

Время Карпрофен (мкг / мл)
До 8
1 ч 31,4
3 ч 31,7
6 ч 26.69

Другая терапия включала Normosol ‐ R (Normosol ‐ R ® , Hospira, Inc) (2 мл / кг / ч), маропитант (Cerenia ® ) (1 мг / кг внутривенно каждые 24 часа) , пантопразол (Protonix ® внутривенно, Premier Healthcare Alliance, LP, Wyeth Pharmaceuticals Inc) (1 мг / кг внутривенно каждые 24 часа) и бупренорфин (Buprenex ® , Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd.) (0,02 мкг / кг в / в каждые 8 ​​часов). В первую ночь госпитализации у больного появилось затруднение при мочеиспускании; поэтому был выполнен декомпрессивный цистоцентез.На следующее утро был установлен постоянный мочевой катетер (SlipperySam ™ Tomcat Urethral Catheter 3.5Fr, Smiths Medical ASD INC) из-за продолжающегося напряжения и невозможности мочеиспускания. Последующие рентгенограммы брюшной полости выявили единственный уролит в мочевом пузыре. Биохимический профиль сыворотки показал новую азотемию, гиперфосфатемию, гипернатриемию и повышение активности аланинаминотрансферазы (таблица). Общий анализ крови без особенностей, за исключением новой анемии легкой степени (таблица). В течение следующих 3 дней его лечили внутривенными жидкостями, постоянным мочевым катетером и продолжали прием всех лекарств.На четвертые сутки госпитализации и стабилизации перенесла перинеальную уретростомию и цистотомию. Он выздоровел после операции без происшествий и был выписан на 5-й день.

3. ОБСУЖДЕНИЕ

Внутривенная липидная эмульсия становится все более популярной в ветеринарии в качестве дополнительного лечения различных интоксикаций, включая местные анестетики, баклофен, перметрины и ивермектины. 14, 15 Имеются также сообщения об использовании ИВС-терапии у собак с передозировкой НПВП с зарегистрированными положительными результатами.Учитывая большую передозировку в этом случае и риски, связанные с медленным выздоровлением у кошек, ILE был выбран в дополнение к традиционному GID, чтобы помочь снизить абсорбцию токсина и предотвратить побочные эффекты. Хотя были сообщения об использовании ILE при интоксикации кошек, насколько известно авторам, это первое сообщение об использовании ILE при передозировке НПВП у кошек.

Преобладающей теорией механизма действия терапии ИВС является модель «стока липидов», которая постулирует, что токсичное соединение изолируется в липидном компартменте в кровотоке.По сути, липидная терапия расширяет липидный компартмент внутри внутрисосудистого пространства, что выводит связанное с тканью лекарственное средство с участков клеточных рецепторов в плазму, тем самым задерживая его в временно расширенной липидной фазе.17 Теория поглощения липидов была продемонстрирована в исследовании с использованием суррогата красителя. для визуализации связывания местного анестетика с помощью липидной эмульсии18. В последнее время статическая модель «липидного стока» была преобразована в динамический «липидный шаттл / метро». Это описание учитывает перераспределение молекулы ксенобиотика из ткани-мишени и перемещение ее в менее опасное место для хранения, метаболизма и / или выведения.19 Эта теория была продемонстрирована в фармакокинетическом исследовании передозировки бупивакаина у крыс, при котором концентрация бупивакаина в плазме быстро увеличивалась после ИВС и впоследствии быстро снижалась из-за перемещения в печень для метаболизма / выведения.20 Другие потенциальные механизмы, благодаря которым терапия ИВС может быть полезной для использование при интоксикациях включает (а) улучшение функции митохондрий путем обеспечения источника жирных кислот для метаболизма, (б) обеспечение кардиомиоцитов энергетическим субстратом и (в) улучшение функции кардиомиоцитов за счет увеличения внутриклеточного кальция.21 год

Способность эмульсии связывать интоксиканты основана на липофильности препарата. Это выражается как его log P, который представляет собой коэффициент распределения, измеряющий растворимость соединения между 2 растворителями.16 Чем выше значение log P , тем более липофильным становится соединение. Лекарства, которые классифицируются как липофильные, обычно имеют log P > 1,0.16. Log P карпрофена составляет 4,13, что делает его очень липофильным.

Концентрация карпрофена в сыворотке у этого пациента достигла пика после введения ИЛЭ.Этот результат подтверждает теорию «липидного стока / челнока», потому что введение ILE, вероятно, изолировало лекарство внутри внутрисосудистой эмульсии, перераспределяя его из тканей во внутрисосудистое пространство. Измерение параллельных уровней триглицеридов и карпрофена может дополнительно подтвердить эту теорию; можно было ожидать, что по мере снижения уровня триглицеридов концентрация карпрофена в плазме должна уменьшаться. Эта теория была задокументирована в отчете о случае, когда терапия ИВС использовалась для лечения передозировки ламотриджина и бупропиона у 17-летней девочки.17 Уровни бупропиона в сыворотке крови совпадали с уровнями триглицеридов до и после инфузии липидов, тогда как для ламотриджина не было отмечено такого увеличения и уменьшения параллельно с уровнями триглицеридов. Бупропион — это высоко липофильный препарат с log P 3,47 по сравнению с ламотриджином с log P -0,19,17.

Способность липидного стока перераспределять фармакологически активные молекулы была также описана в физиологически обоснованной фармакокинетической модели, исследующей передозировку местного анестетика у людей.В этом исследовании сообщалось о снижении концентрации бупивакаина на тканевом уровне и повышении общей концентрации в плазме в присутствии липидов; однако он также пришел к выводу, что поглощение липидов не является единственным механизмом, с помощью которого липидная эмульсия, вводимая внутривенно, снижает системную токсичность местного анестетика22.

Анализ, использованный в этом отчете, измеряет как связанную, так и несвязанную фракцию лекарственного средства. Таким образом, анализ представляет общее количество и не делает различий между свободным лекарственным средством и фракцией, связанной с белком.Несмотря на высокое связывание карпрофена с белками, возможное накопление в липидной матрице происходит из-за того, что связанные с белком и несвязанные фракции находятся в равновесии. Когда несвязанная фракция поглощается липидной матрицей, несвязанная фракция будет заменена для поддержания этого равновесия.23 Высокие концентрации карпрофена в плазме после лечения липидами, вероятно, связаны с притяжением липидов в плазме и сниженным распределением. в отделение для тканей.

Рекомендации по дозировке и показания для введения ИВС пациентам-людям описаны в заявлении о позиции, опубликованном Американским колледжем медицинской токсикологии (ACMT).24 Рекомендуемый режим дозирования — болюс 1,5 мл / кг в течение 2–3 минут с последующей непрерывной инфузией со скоростью 0,25 мл / кг / мин в течение 1 часа. Для пациентов-людей рекомендуется ограничивать дозы ILE до 10% от общего объема крови, чтобы избежать перегрузки липидами и ограничить возможные осложнения, возникающие из-за повышенных концентраций триглицеридов.25 Доза, выбранная для этого пациента, была аналогична рекомендованной. доза указана в заявлении ACMT по ILE. В учреждении автора повторные дозы вводятся каждые 2-6 часов в зависимости от стойкости клинических признаков, а также наличия липемии в сыворотке.Дополнительных доз этой кошке не давали из-за отсутствия клинических признаков, наличия липемической сыворотки и опасений по поводу возможных побочных эффектов.

Большинство потенциальных рисков ИВС могут быть экстраполированы при парентеральном введении питания и включают «синдром жировой перегрузки», вызывающий жировую эмболию, гемолиз, гиперлипидемию и увеличение времени свертывания крови; перегрузка по объему; панкреатит; тошнота и рвота. 26 В отношении кошек было зарегистрировано два случая липидоза роговицы после введения ILE по поводу токсикоза перметрина.27, 28 Обе эти кошки получили дозу, значительно превышающую рекомендованные 10% от общего объема крови, и единственным отмеченным побочным эффектом был липидоз роговицы в сочетании со стойкой липемией и гипертриглицеридемией. В недавнем исследовании, посвященном влиянию ИЛЭ на амитриптилин на модели крыс, было высказано предположение, что повышенная гемодинамическая нестабильность, отмеченная у крыс, получавших ИВС, была связана с увеличением абсорбции лекарственного средства из желудочно-кишечного тракта.29 Дальнейшие исследования фармакокинетики и фармакодинамики ИВС в ветеринарии пациенты должны лучше понимать подходящую дозировку.

Удивительно, но пиковая концентрация карпрофена в плазме у этого пациента оказалась намного ниже ожидаемой. Значения, перечисленные в таблице, аналогичны или меньше значений, которые были ранее зарегистрированы, когда кошкам внутривенно вводили 4 мг / кг с теми же временными интервалами. снижению концентрации карпрофена в плазме крови. Несколько исследований на собаках показали, что AC снижает концентрацию карпрофена в плазме 10, 30; однако, насколько известно авторам, эффективность AC в снижении концентрации карпрофена на кошках не проводилась.

К сожалению, у этого пациента во время госпитализации развилась непроходимость мочевыводящих путей, поэтому неизвестно, было ли развитие азотемии почечной или постренальной причиной. Учитывая, что пациент получал жидкости внутривенно на протяжении всей госпитализации и ежедневно оценивался на предмет признаков обезвоживания, преренальные причины азотемии считались маловероятными. Анализ мочи для выявления признаков возможного острого повреждения почек, таких как цилиндры или белок, не проводился, что могло быть полезно для подтверждения механизма азотемии.В предыдущих сообщениях о терапии ИЛЭ при передозировке ибупрофена и напроксена у собак только в 1 из 4 случаев развилась азотемия.

В будущих исследованиях можно было бы проспективно оценить плазменные концентрации карпрофена до и после введения ИВС, чтобы дополнительно подтвердить, что механизм поглощения липидов увеличивает плазменные концентрации препарата; тем самым перемещаясь в плазму для выведения. Это можно отслеживать вместе с уровнями триглицеридов, чтобы доказать, что, хотя уровни триглицеридов высоки (из-за введения ILE), концентрации в плазме остаются высокими.Поскольку лекарственное средство и липидная эмульсия выводятся через почки, концентрации триглицеридов и лекарственного средства в плазме должны соответственно уменьшаться.

Способность ИВС-терапии предотвращать побочные эффекты, связанные с передозировкой НПВП, в этом случае неизвестна. Пациент не продемонстрировал каких-либо побочных эффектов со стороны желудочно-кишечного тракта, но у него развилась азотемия. К сожалению, из-за развития обструкции уретры нельзя исключить постренальные причины азотемии. Уровни карпрофена в сыворотке действительно увеличились, что свидетельствует о переносе / секвестрации препарата в плазме, ограничивая воздействие на органы-мишени.Однако это не обязательно приводит к клиническому улучшению, поскольку достаточное количество лекарственного средства все еще может достичь органа-мишени, вызывая повреждение. Кроме того, другие методы обеззараживания могут сыграть роль в уменьшении осложнений, связанных с передозировкой НПВП. Будущие исследования по измерению концентрации карпрофена после терапии ИВС по сравнению со стандартным РГИ могут помочь подтвердить эффективность терапии ИВС.

Хотя выздоровление пациента не может быть отнесено к одной конкретной терапии, этот отчет поддерживает механизм действия ILE по поглощению липидов, посредством которого токсин блокируется во внутрисосудистом пространстве, предотвращая его повреждение ткани-мишени.Внутривенное введение липидной эмульсии в указанных дозах хорошо переносилось без каких-либо побочных эффектов, кроме преходящей липемии. Учитывая пониженную способность кошачьих метаболизировать НПВП, ИЛЭ может играть важную роль в лечении токсикоза у этого вида.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Не заявлено.

ВКЛАД АВТОРА

НСК: был основным автором, задумал и разработал исследование, проанализировал и интерпретировал данные, а также подготовил и критически отредактировал рукопись.JCS: был основным соавтором, задумал и разработал исследование, проанализировал и интерпретировал данные, а также подготовил и критически отредактировал рукопись. DIM: был соавтором, задумал и разработал исследование, проанализировал и интерпретировал данные и критически отредактировал рукопись. MGP: был соавтором, проанализировал и интерпретировал данные и критически отредактировал рукопись.

Банкноты

Чамблер Н.С., Шилдт Дж.С., Моуби Д.И., Папич М.Г. Применение внутривенной липидной терапии кошке при передозировке карпрофена.Clin Case Rep. 2020; 8: 653–657. 10.1002 / ccr3.2772 [CrossRef] [Google Scholar]

ССЫЛКИ

1. Means C, Wismer T. Обзор тенденций в отношении случаев отравления животных в США: 2011–2017 гг. Ветеринарная клиника North Am Small Anim Pract. 2018; 48 (6): 899-907. [PubMed] [Google Scholar] 2. Lascelles BD, Court MH, Hardie EM, Robertson SA. Нестероидные противовоспалительные препараты для кошек: обзор. Vet Anaesth Analg. 2007; 34 (4): 228-250. [PubMed] [Google Scholar] 3. Стигалл П.В., Моутиньо Ф.К., Мантовани Ф.Б. и др.Оценка побочных эффектов подкожного введения карпрофена в течение шести дней у здоровых кошек. Res Vet Sci. 2009; 86 (1): 115-120. [PubMed] [Google Scholar] 4. Суд MH. Метаболизм и распределение лекарств у кошек: фармакокинетические данные о видовых различиях и молекулярных механизмах. Ветеринарная клиника North Am Small Anim Pract. 2013; 43 (5): 1039-1054. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 5. Тейлор П.М., Делатур П., Ландони Ф.М. и др. Фармакодинамика и энантиоселективная фармакокинетика карпрофена у кошек.Res Vet Sci. 1996; 60 (2): 144-151. [PubMed] [Google Scholar] 6. Партон К., Балмер Т.В., Бойл Дж. И др. Фармакокинетика и эффекты внутривенного введения карпрофена и салицилата на слизистую желудочно-кишечного тракта и отдельные биохимические измерения у здоровых кошек. J Vet Pharmacol Ther. 2000; 23 (2): 73-79. [PubMed] [Google Scholar] 7. Schmitt M, Guentert TW. Биофармацевтическая оценка карпрофена после однократного внутривенного, перорального и ректального введения собакам. Утилизация лекарств Biopharm. 1990; 11 (7): 585-594.[PubMed] [Google Scholar] 8. Ранк А, Кайлс А.Е., Даунс, штат Миссури. Перфорация двенадцатиперстной кишки у кошки после приема нестероидных противовоспалительных препаратов. J Am Anim Hosp Assoc. 1999; 35 (1): 52-55. [PubMed] [Google Scholar] 9. Холдейн С.Н. Противовоспалительные препараты В: Silverstein DC, Hopper K, eds. Медицина интенсивной терапии мелких животных (2-е изд.). Сент-Луис, Миссури: Эльзевир, Сондерс; 2015: 395-4398. [Google Scholar] 10. Raekallio MR, Honkavaara JM, Säkkinen MS, Peltoniemi SM. Влияние подщелачивания мочи и активированного угля на фармакокинетику перорального карпрофена у собак.Am J Vet Res. 2007; 68 (4): 423-427. [PubMed] [Google Scholar] 11. Болфер Л., МакМайкл М., Нгвеньяма Т.Р., О’Брайен Массачусетс. Лечение токсикоза ибупрофена у собак с помощью липидной эмульсии внутривенно. J Am Anim Hosp Assoc. 2014; 50 (2): 136-140. [PubMed] [Google Scholar] 12. Херринг Дж. М., Мак-Майкл М. А., Корси Р., Вурлод В. Внутривенная липидная эмульсионная терапия в трех случаях передозировки напроксена у собак. J Vet Emerg Crit Care. 2015; 25 (5): 672-678. [PubMed] [Google Scholar] 13. Becker MD, Young BC. Лечение тяжелых липофильных интоксикаций внутривенной липидной эмульсией: серия случаев.Vet Med. 2017; 8: 77-85. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 14. Peacock RE, Hosgood G, Swindells KL, Smart L. Рандомизированное контролируемое клиническое испытание внутривенной липидной эмульсии в качестве дополнительного лечения токсикоза перметрина у кошек. J Vet Emerg Crit Care. 2015; 25 (5): 597-605. [PubMed] [Google Scholar] 15. Ceccherini G, Perondi F, Lippi I, et al. Внутривенная липидная эмульсия и дексмедетомидин для лечения интоксикации перметрином у кошек: отчет о 4 случаях. Open Vet J. 2015; 5 (2): 113-121.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 16. Фернандес А.Л., Ли Дж. А., Рахилли Л. и др. Применение липидной эмульсии для внутривенного введения в качестве противоядия в ветеринарной токсикологии. J Vet Emerg Crit Care. 2011; 21 (4): 309-320. [PubMed] [Google Scholar] 17. Сирианни А.Дж., Остерхоудт К.С., Калелло Д.П. и др. Применение липидной эмульсии в реанимации пациента с длительным сердечно-сосудистым коллапсом после передозировки бупропиона и ламотриджина. Ann Emerg Med. 2008; 51 (4): 412-415. [PubMed] [Google Scholar] 18. Пападопулу А., Виллерс Дж. В., Сэмюэлс Т.Л., Дядя Д.Р.Использование суррогатов красителя для иллюстрации связывания местного анестетика липидной эмульсией и визуальной демонстрации эффекта поглощения липидов. Reg Anesth Pain Med. 2012; 37 (2): 183-187. [PubMed] [Google Scholar] 19. Хорошо SH, Hong JM, Lee SH, Shon JT. Липидная эмульсия для лечения системной токсичности местных анестетиков. Int J Med Sci. 2018; 15 (7): 713-722. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 20. Shi K, Xia Y, Wang Q и др. Влияние липидной эмульсии на фармакокинетику и тканевое распределение бупивакаина у крыс.Anesth Analg. 2013; 116 (4): 804-809. [PubMed] [Google Scholar] 21. Каплан А., Уилан М. Использование липидной эмульсии для лечения токсичности липофильных лекарств. J Am Anim Hosp Assoc. 2012; 48 (4): 221-227. [PubMed] [Google Scholar] 22. Куо И., Акпа Б.С. Обоснованность липидного стока как механизма устранения системной токсичности местных анестетиков. Анестезиология. 2013; 118: 1350-1361. [PubMed] [Google Scholar] 23. Bowman CM, Benet LZ. Изучение связывания с белками и усвоения с помощью белков, относящееся к экстраполяции in vitro и in vivo.Eur J Pharm Sci. 2018; 15 (123): 502-514. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 24. Заявление о позиции ACMT Американского колледжа медицинской токсикологии: временное руководство по использованию липидной реанимационной терапии. J Med. Toxicol. 2011; 7: 81-82. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 25. Госселин С., Хёгберг Л.С., Хоффман Р.С. и др. Доказательные рекомендации по применению внутривенной липидной эмульсионной терапии при отравлении. Clini Toxicol. 2016; 54: 899-923. [PubMed] [Google Scholar] 26. Цао Д., Херд К., Форан М., Койфман А.Внутривенная липидная эмульсия в отделении неотложной помощи: систематический обзор последней литературы. J Emerg Med. 2015; 48 (3): 387-397. [PubMed] [Google Scholar] 27. Зейтц М., Кридон Дж. Стойкая макрогенная липемия и подозрение на липидоз роговицы после внутривенной липидной терапии у кошки с токсикозом перметрина. J Vet Emerg Crit Care. 2016; 26 (6): 804-808. [PubMed] [Google Scholar] 28. Yuh EL, Keir I. Гипертриглицеридемия и преходящий липидоз роговицы у кошек после внутривенной липидной терапии перметринового токсикоза.Кан Вет Дж. 2018; 59 (2): 155-158. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29. Перихон Д., Турфус С., Геростамулос Д. и др. Оценка in vivo эффектов внутривенной липидной эмульсии на концентрацию лекарств в крови и гемодинамику после передозировки амитриптилина в желудочно-кишечном тракте. Clin Toxicol. 2019; 51 (4): 208-215. [PubMed] [Google Scholar] 30. Кенигсхоф AM, Бил М.В., Поппенга Р.Х., Ютковиц, Лос-Анджелес. Влияние сорбита, однократного и многократного введения активированного угля на абсорбцию карпрофена после экспериментальной передозировки у собак.J Vet Emerg Crit Care. 2015; 25 (5): 606-610. [PubMed] [Google Scholar]

Микробиота кишечника человека от расстройства аутистического спектра способствует поведенческим симптомам у мышей

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.004Получить права и контент

Основные моменты

Мыши с ASD, но не TD, микробиомы демонстрируют ASD-подобное поведение

ASD и TD микробиота продуцируют дифференциальные профили метаболома у мышей Микробиота РАС

У мышей BTBR, получавших 5AV или таурин, улучшилось повторяющееся и социальное поведение

Резюме

Расстройство аутистического спектра (РАС) проявляется как изменения в сложном человеческом поведении, включая социальное общение и стереотипы.Помимо генетических рисков, микробиом кишечника различается у людей с типично развивающимся (TD) и ASD, хотя остается неясным, способствует ли микробиом симптомам. Мы трансплантировали кишечную микробиоту от людей-доноров с контролем ASD или TD беспроблемным мышам и показали, что колонизации микробиотой ASD достаточно, чтобы вызвать характерное аутичное поведение. В мозге мышей, колонизированных микробиотой РАС, наблюдается альтернативный сплайсинг генов, относящихся к РАС. Профили микробиома и метаболома мышей, являющихся носителями микробиоты человека, предсказывают, что определенные бактериальные таксоны и их метаболиты модулируют поведение РАС.Действительно, обработка модели мышей с РАС кандидатными микробными метаболитами улучшает поведенческие аномалии и модулирует возбудимость нейронов в головном мозге. Мы предполагаем, что микробиота кишечника регулирует поведение мышей посредством выработки нейроактивных метаболитов, предполагая, что связи между кишечником и мозгом вносят вклад в патофизиологию РАС.

Ключевые слова

Расстройство аутистического спектра

аутизм

микробиом кишечника

микробиота

ось кишечник-мозг

метаболом

модель мыши

бактериальные метаболиты

000 Рекомендуемые статьи

Else, 2019

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Расширенная последовательность Шайна – Дальгарно в мРНК функционально обходит жизненно важный дефект в тРНК инициатора

Значимость

Инициация, этап регуляции трансляции мРНК характеризуется тРНК инициатора (тРНК fMet ) связывание с 30S рибосомой вместе с факторами инициации (IF) с образованием 30S преинициативного комплекса (PIC). За этой стадией следует связывание 50S рибосомы и высвобождение IF с образованием компетентного к элонгации 70S комплекса.тРНК fMet является особенной тем, что обладает важной особенностью трех последовательных пар оснований G-C (3GC) в своем антикодоновом стержне. Однако роль этой функции осталась неясной. Мы показываем, что пары оснований 3GC способствуют удержанию тРНК fMet в рибосоме во время переходов, которые отмечают превращение 30S PIC в 70S комплекс. Более того, мы показываем, что трансляция мРНК, имеющих расширенную последовательность Shine-Dalgarno, обходит потребность в парах 3GC в тРНК fMet .

Abstract

Инициаторные тРНК отличаются своим прямым связыванием с рибосомным Р-сайтом из-за характерного появления трех последовательных пар оснований G-C (пар 3GC) в их антикодонных основах. Как пары 3GC функционируют в этой роли, остается нерешенным. Мы показываем, что мутации в мРНК или 16S рРНК, ведущие к расширенному взаимодействию между последовательностями Шайна – Далгарно (SD) и анти-SD, компенсируют жизненно важную потребность пар 3GC в тРНК fMet для их функции в Escherichia coli .In vivo мутантная 3GC тРНК fMet встречается реже в 70S рибосомах, но обычно на 30S субъединицах. Однако расширенное взаимодействие SD: anti-SD увеличивало его присутствие в 70S рибосомах. Мы предполагаем, что пары 3GC играют критическую роль в удерживании тРНК fMet в рибосоме во время конформационных изменений, которые маркируют переход преинициативного комплекса 30S в компетентный к элонгации 70S комплекс. Кроме того, обработка клеток касугамицином, снижение активности фактора рециклинга рибосом (RRF) или повышение уровня фактора инициации 2 (IF2) усиливали инициацию с помощью мутантной 3GC тРНК fMet , предполагая, что режим инициации 70S меньше зависит от пар 3GC в тРНК fMet .

Инициирование синтеза белка при помощи факторов инициации — это строго регулируемый процесс для всех форм жизни. У эубактерий связывание как инициаторной тРНК (тРНК fMet ), так и мРНК с малой рибосомной субъединицей (30S) приводит к образованию преинициативного комплекса 30S, главным образом с помощью трех факторов инициации (IF1, IF2 и IF3). ). Затем за этой стадией следует стыковка большой рибосомной субъединицы (50S), чтобы в конечном итоге произвести компетентный к элонгации 70S комплекс при отклонении всех трех факторов инициации (1).Локализации мРНК на субъединице 30S способствует богатая пуринами последовательность (последовательность Шайна-Дальгарно, SD), расположенная перед стартовым кодоном, путем ее спаривания с комплементарной последовательностью (последовательность анти-SD) на 3′-конце. 16S рРНК (1, 2). Связывание тРНК fMet с рибосомой происходит благодаря уникальным свойствам, которыми она обладает. Практически универсальная особенность всех инициаторных тРНК, наличие трех последовательных пар оснований GC (G 29 G 30 G 31 : C 39 C 40 C 41 , обозначаемых как 3GC пары) в стебле антикодона, как известно, важны для их преимущественного связывания в рибосомном Р-сайте (3, 4).Мутации в парах 3GC приводят к плохому связыванию тРНК fMet с рибосомным P-сайтом (3, 4).

Однако механизм того, как пары 3GC помогают в связывании тРНК fMet с рибосомой, остается неясным. В кристаллической структуре инициаторной тРНК, связанной с рибосомой 70S, было видно, что универсально консервативные остатки A1339 и G1338 16S рРНК устанавливают A-минорные взаимодействия с первым GC (G 29 -C 41 ) и средним GC ( G 30 -C 40 ) пар соответственно (5).Хотя эти взаимодействия считались субоптимальными, вызванные IF3 конформационные изменения могут оптимизировать эти взаимодействия (6). Другое исследование показало, что основная роль IF3 заключается в равномерном увеличении скорости диссоциации всех тРНК (включая тРНК fMet ) от преинициативных комплексов 30S (7). Эти наблюдения предполагают, что роль пар 3GC в придании специфичности связыванию Р-сайта рибосом остается открытым вопросом.

Формирование компетентного к элонгации комплекса 70S представляет собой многоступенчатый процесс, в котором как тРНК fMet , так и IF2 способствуют стыковке субъединицы 50S с комплексом предварительной инициации 30S.Образованный таким образом комплекс 70S находится в храповидном состоянии с тРНК fMet , связанной в состоянии P / I, при этом стебель антикодона тРНК помещается в P-сайт, а акцепторный стержень помещается между P- и E-, сайтами. . Для того чтобы такой комплекс 70S вступил в фазу элонгации, состояние с храповым механизмом должно развязаться, чтобы локализовать тРНК fMet в классическом сайте P / P и сделать сайт A / A доступным для входа элонгаторной тРНК. Расцепление опосредуется гидролизом связанного с IF2 GTP (8).Какие конкретные взаимодействия между рибосомой и тРНК fMet способствуют удержанию последней в комплексе 70S во время этих конформационных переходов, неизвестно. Также неизвестно, играют ли пары 3GC в основе антикодона тРНК fMet какие-либо специфические роли во время этих переходов.

Чтобы глубже понять роль пар 3GC в процессе инициации, мы использовали генетический подход для получения штаммов-супрессоров Escherichia coli , которые позволяют инициации происходить с тРНК fMet , имеющей мутации в парах 3GC. (9).В этом исследовании характеристика одного из изолятов, B21, показала, что мутация C1536-to-T1536 в 3′-концевой области 16S рДНК, приводящая к ее расширенному взаимодействию с SD-областью репортерной мРНК, позволяла происходить инициации. с мутантной тРНК fMet , лишенной высококонсервативной особенности пар оснований 3GC в стебле антикодона.

Результаты

Анализ in vivo и характеристика мутации B21, обеспечивающей инициирование мутантной тРНК 3GC

fMet в E.coli .

Плазмида pCAT am1 (Amp R ) кодирует репортерную мРНК хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) со стартовым кодоном UAG (в отличие от AUG), которая не транслируется в нормальных физиологических условиях. Таким образом, его присутствие (pCAT am1 ) не придает устойчивости к хлорамфениколу (Cm) E. coli (рис. 1 B , ii , сектор 1). Однако одновременное присутствие мутантного гена metY , metY CUA , который кодирует тРНК fMet с антикодоном CUA (вместо CAU) в pCAT am1 metY , приводит к инициации CUA 910. от стартового кодона UAG репортерной мРНК, придающей устойчивость к Cm (Cm R ) хозяину (рис.1 A , i и B , ii , сектор 2) (10). Неудивительно, что когда metY CUA подвергается дальнейшей мутации для замены высококонсервативных пар 3GC в стебле антикодона на U 29 : A 41 , C 30 : G 40 , A 31 : Ψ 39 , новая конструкция (pCAT am1 metY CUA / 3GC ) не может предоставить Cm R , потому что закодированная тРНК fMet (в дальнейшем называемая тРНК 3GC) не может успешно участвовать в инициации (Инжир.1 A , ii и B , ii , сектор 3), несмотря на его эффективное аминоацилирование и формилирование (3, 10, 11).

Рис. 1.

Система анализа и характеристика штамма супрессора B21. ( A , i ) Плазмида pCAT am1 metY CUA несет в себе гены CAT am1 и metY CUA , которые кодируют кодировку CAT am1 910 am1 и мРНК CAT am1 мРНК fMet , имеющий антикодон CUA, соответственно.ТРНК, кодируемая metY CUA , инициируется из мРНК CAT am1 с образованием белка CAT и передает Cm R хозяину. Соответствующие последовательности петли стебля антикодона (прямоугольник с пунктирной линией) показаны на рисунке. ( ii ) Плазмида pCAT am1 metY CUA / 3GC получена из pCAT am1 metY CUA , где три следующих друг за другом гена GCA metY CUA подверглись мутации. пар оснований.Кодируемая тРНК (3GC тРНК) не может инициироваться с мРНК CAT am1 , передающей Cm S хозяина. ( B ) Рост родительского штамма E. coli KL16 (секторы 1–3) и производного супрессора B21 (секторы 4–6), несущего либо pCAT am1 , либо pCAT am1 metY CUA или pCAT am1 metY CUA / 3GC на чашках с LB-агаром, содержащими Amp ( i ) и Amp plus Cm (100 и 30 мкг / мл соответственно) ( ii ).Ночные культуры наносили штрихами и инкубировали при 37 ° C в течение ~ 18 часов. ( C ) Взаимодействие последовательности CAT am1 SD с анти-SD последовательностью 16S рРНК ( rrsC ) дикого типа ( i ) или мутантной B21 ( ii ).

В нашей более ранней работе (9) мы выделили штамм E. coli B21, в котором хромосомная мутация устраняет дефект инициации тРНК 3GC, чтобы предоставить Cm R (рис.1 B , ii , сектор 6 ). В качестве контроля B21, содержащий pCAT am1 , остается Cm-чувствительным (Cm S ) и сохраняет Cm R с pCAT am1 metY CUA (рис.1 B , ii , секторы 4 и 5). В качестве еще одного контроля все трансформанты растут на чашке с одним Amp (фиг. 1 B, i ). Генетическое картирование с использованием трансдукций, опосредованных фагом P1 (результаты SI ), локализовало сайт мутации в B21 на 84,5 мин в хромосоме E. coli (фиг. S1 A ). В этом месте наиболее вероятным кандидатом был ген rrsC (кодирующий один из семи генов 16S рРНК). Анализ последовательности ДНК выявил новую мутацию C-to-T в rrsC , соответствующую замене C на U в положении 1536 (обозначенную как c1536u или мутация B21) в кодируемой 16S рРНК (рис.S1 B ) в области анти-SD (aSD) (12), что привело к расширенному взаимодействию с областью SD репортерной мРНК с 6 до 8 пар оснований (рис.1 C , сравните i и ii ).

Влияние расширенного SD: взаимодействие aSD на инициацию с мутантом 3GC и тРНК дикого типа

fMet .

Чтобы создать обратную систему расширенного взаимодействия SD: aSD, мы мутировали последовательность SD мРНК репортера CAT с UAAGGAAG на UAAGGAGG в pCAT am1 (a7g) (конструкция SD a7g ), чтобы обеспечить расширенное взаимодействие с дикой природой. -типа 16S рРНК (рис.2 А ). Чтобы проверить влияние расширенного SD на инициацию с помощью тРНК 3GC, плазмиды pCAT am1 metY CUA / 3GC или pCAT am1 (a7g) metY CUA / 3GC были введены в родительские плазмиды. штамм KL16 и его производное B21. Анализы CAT показали, что по сравнению с исходной конструкцией (SD wt ) конструкция a7g (SD a7g ) приводила к эффективному инициированию тРНК 3GC даже в родительском штамме (KL16).Фактически, инициация в KL16 была выше, чем в B21 (рис. 2 B ). Вероятной причиной этого является то, что, хотя мРНК CAT am1 (SD wt ) может предпочтительно использоваться только одним геном ( rrsC ), кодирующим рРНК 16S в B21, мРНК CAT am1 (a7g) (SD a7g ) может использоваться 16S рРНК, кодируемой всеми семью генами в KL16, и шестью из семи генов в B21 (седьмой имеет мутацию B21). Это наблюдение предполагает, что одного расширенного взаимодействия SD: aSD достаточно, чтобы позволить эффективную инициацию с помощью тРНК 3GC.

Рис. 2.

Влияние расширенного SD на инициацию трансляции. ( A ) Схема взаимодействия SD a7g CAT am1 с анти-SD (aSD) 16S рРНК дикого типа. ( B ) Инициирование тРНК 3GC, как оценивали по активности CAT в бесклеточных экстрактах штаммов E. coli KL16 или B21, несущих репортер CAT am1 в контексте SD wt или SD a7g . Показаны складчатые различия в активности CAT по отношению к тРНК 3GC в KL16.Активность CAT в KL16 для контекста SD wt составляла 110,4 ± 58,8 пмоль ацетилированного (Ac) Cm, продуцируемого на мкг общего белка за 20 мин при 37 ° C. ( C ) Инициирование из CAT am1 с metY CUA (столбцы 1 и 2), metY CUA / AU (столбцы 3 и 4), metY CUA / GU (столбцы 5 и 6) и metY CUA / 3GC (столбцы 7 и 8) тРНК в контексте SD wt или SD a7g .Показаны кратные различия в активности CAT по отношению к metY CUA в контексте SD wt . CAT-активность metY CUA в контексте SD wt составляла 5236,4 ± 1204,5 пмоль Ac-Cm на мкг общего белка. ( D ) Анализы CAT на основе бесклеточных экстрактов E. coli KL16, несущих pCAT am1 metY CUA / 3GC вместе с пустым вектором pACDH (столбцы 1 и 3) или другой конструкцией для CAT am1 мРНК, pACDHCAT am1 (столбцы 2 и 4), с (столбцы 3 и 4) или без (столбцы 1 и 2) 0.5 мМ IPTG. Абсолютная активность CAT для реакции, представленной столбцом 1, составляет 116,1 ± 18,3 пмоль Ac-Cm на мкг общего белка. ( E ) Анализ сверхэкспрессии мРНК CAT am1 с помощью полуколичественной ПЦР.

Подобно более ранним исследованиям (13, 14), мы наблюдали, что по сравнению с SD wt , расширенный SD (SD a7g ) вызывал снижение инициации с помощью metY CUA , сохраняя последовательность дикого типа в своем ножка антикодона (рис. 2 C , сравните столбцы 1 и 2).Однако такой неблагоприятный эффект SD a7g не наблюдался, когда из трех последовательных пар оснований GC мы мутировали только первую в AU в metY CUA / AU (столбцы 3 и 4) или третью в GU в metY CUA / GU (стержни 5 и 6). Фактически, конструкция metY CUA / GU показала увеличение инициации. В качестве контроля конструкция metY CUA / 3GC показала ожидаемое увеличение (столбцы 7 и 8). Кроме того, мы наблюдали, что повышенная продукция мРНК CAT am1 (путем введения другой копии гена CAT am1 в другую плазмиду со средней копией, pACDHCAT am1 , совместимую с pCAT am1 ) в KL16 не компенсировала для мутаций 3GC (рис.2 D и E ), предполагая, что механизм восстановления дефекта 3GC в B21 был маловероятным из-за простого прямого воздействия расширенного SD на начальное связывание мРНК CAT am1 с рибосомой, или на раннем событии в инициации.

В другом эксперименте анализ связанной с рибосомой фракции мРНК CAT am1 в B21 с помощью Нозерн-блоттинга и ОТ-ПЦР показал увеличение в 2–4 раза (по сравнению с KL16). Аналогичным образом мРНК CAT am1 (a7g) также увеличивалась на ~ 3.7-7-кратная в рибосомах KL16 (рис. 3 A , i и B ). Мы отметили, что уровни, определенные Нозерн-блоттингом, были ниже. Что еще более важно, уровни тРНК 3GC на рибосомах также увеличиваются примерно в три раза (Fig. 3 A , ii ).

Рис. 3.

Связывание мРНК и тРНК 3GC с рибосомами. ( A ) Нозерн-блоттинг мРНК CAT am1 ( i ), 3GC тРНК ( ii ) и 5S рРНК ( iii ) в рибосомных гранулах.РНК (~ 20 мкг) разделяли на 1,2% агарозном геле, переносили на мембрану nytran и последовательно зондировали на CAT am1 , 3GC тРНК и 5S рРНК. Интенсивности сигналов мРНК CAT am1 и тРНК 3GC были разделены на интенсивности соответствующих сигналов 5S рРНК. Значения, полученные таким образом для штамма KL16, несущего pCAT am1 metY CUA (3GC-SD wt ), были установлены как 1, а остальные значения были рассчитаны относительно этого эталонного значения 1 для обоих CAT am1 и тРНК 3GC.( B ) Кратное увеличение мРНК CAT am1 , связанной с рибосомами, по результатам количественной ПЦР с использованием 16S рРНК в качестве внутреннего контроля.

Можно отметить, что непосредственно перед SD-последовательностью в репортере CAT am1 еще одна последовательность, AGGAG, которая, хотя и неоптимально размещена по отношению к стартовому кодону, также может служить в качестве SD-последовательности. Однако, как показано на фиг. S2, мутации в этой последовательности не привели к каким-либо значительным эффектам.

Распределение тРНК дикого типа

fMet и тРНК 3GC с CAU Anticodon (3GC CAU ) в 30S и 70S рибосомах.

Препараты полисом из штамма KL16, несущего p metY 3GC , кодирующую 3GC CAU тРНК, фракционировали по градиентам плотности сахарозы (20-40%) (рис. 4 A , i ) и анализировали на наличие тРНК дикого типа fMet и тРНК 3GC CAU через профиль седиментации с помощью дот-блот-гибридизации (фиг. 4 A , ii ). Как показано на рис. 4 A , iii , во фракционном распределении тРНК по фракциям градиента 6-17 уровни свободной тРНК и уровни, связанные с 30S рибосомами, были представлены примерно одинаковыми уровнями (рис. .4 A , iii , F6-F7 и F8-F10). Однако во фракциях 70S (F13 – F17) тРНК дикого типа fMet связывалась более заметно, чем тРНК 3GC CAU . Такое фракционное распределение тРНК показывает, что тРНК 3GC CAU не является дефектной в связывании с 30S, и предполагает, что первичная роль пар 3GC может заключаться во время транзита тРНК fMet от 30S к комплексу 70S. Чтобы подтвердить эти результаты, в еще одном эксперименте (рис.4 B ) мы отдельно собрали фракции рибосом 30S, 50S и 70S (рис.4 B , i ) и проанализировали их методом Нозерн-блоттинга (рис. 4 B , ii ). В этом анализе, в то время как тРНК дикого типа fMet в основном обнаруживалась в комплексе 70S, только небольшая часть тРНК 3GC CAU находилась в 70S. Соотношения связанных фракций 70S и 30S (фиг. 4 B , iii ) также показали то же самое. Интересно, что в отличие от случая с тРНК fMet , мы наблюдали, что значительная часть тРНК 3GC CAU также была обнаружена мигрирующей с 50S.Эта миграция, скорее всего, связана с его более слабой ассоциацией с 70S, что приводит к диссоциации его части во время центрифугирования. Также можно отметить, что в E. coli K тРНК дикого типа fMet , кодируемая metZWV (~ 75%) и metY (~ 25%), разделяется на тРНК fMet1 и тРНК . fMet2 полос (дублет) при анализе на нативном геле, показанном на фиг. 4 B , ii . Ожидается, что оба вида тРНК fMet обнаруживают сходное распределение.

Рис. 4.

Связывание тРНК 3GC CAU (антикодон дикого типа) с 30S и 70S рибосомами. ( A ) Анализ тРНК 3GC CAU по рибосомному профилю. Рибосомные субъединицы и полисомы разделяли на 20-40% градиенте сахарозы с использованием ротора SW55 (48000 об / мин в течение 3 часов) ( i ). Дот-блоттинг из фракций с номерами 6-17 был проведен для тРНК 3GC CAU и тРНК fMet . Показаны дот-блоты для двух биологических повторов ( ii ).Долю тРНК в каждом профиле измеряли путем деления интенсивности отдельных пятен на общую интенсивность в профиле и распределение, показанное в виде столбиковой диаграммы ( iii ), для тРНК дикого типа (открытая полоса) и тРНК 3GC CAU (черная полоса). ( B ) Субъединицы и полисомы разделяли на 20-40% градиенте сахарозы, как в A , и пики 30S, 50S и 70S собирали отдельно путем мониторинга рибосомного профиля ( i ). Экстрагированную РНК анализировали на нативном PAGE, переносили на мембрану nytran и исследовали на наличие 3GC CAU , а также тРНК fMet ( ii ).Их фракционное распределение между субъединицами и рибосомой 70S показано на рисунке ( iii ).

Extended SD способствует переходу тРНК 3GC в комплекс 70S.

Анализ на рис. 4 показал, что одним из дефектов инициации с тРНК 3GC CAU является ее переход от 30S к 70S рибосоме. Следовательно, чтобы понять механизм того, как расширенный SD спасает дефект тРНК 3GC, мы провели анализ градиента плотности сахарозы (рис. 5 A , i и ii ), чтобы определить распределение тРНК 3GC (i .е., с антикодоном CUA) и тРНК fMet . Мы обнаружили, что в случае SD дикого типа (SD wt ) тРНК 3GC хорошо связывалась с 30S, но не с фракциями рибосомы 70S (фиг. 5 B , SD wt ). Интересно, что было больше тРНК 3GC на фракциях 70S в образце с расширенным контекстом SD (фиг. 5 B , SD a7g ). Количественный анализ (рис. 5 C ) также показал то же самое. С другой стороны, SD a7g , по-видимому, не вносил изменений в распределение тРНК дикого типа fMet (рис.5 B и C ). Эти результаты показывают, что компенсация дефекта пары 3GC SD a7g произошла на этапе, следующем за его начальным связыванием с субъединицей 30S, наиболее вероятно на этапе его перехода в комплекс 70S.

Рис. 5.

Влияние SD a7g на связывание тРНК 3GC. ( A ) Анализ градиентов плотности сахарозы (20–40%) клеточных лизатов штамма KL16, несущего pCAT am1 metY 3GC / CUA с SD wt ( i ) или SD a7g ( ii ).( B ) Нозерн-блоттинг на тРНК 3GC и тРНК fMet по профилю. ( C ) Фракционное распределение тРНК по фракциям, измеренное путем деления индивидуальных интенсивностей на общую интенсивность во всех фракциях.

Extended SD также упрощает запуск через 70S Pathway.

Было показано, что удлиненная SD приводит к образованию 70S рибосомных комплексов без инициаторной тРНК (15). Кроме того, известно, что рибосомы 70S инициируются в различных специализированных условиях (16–20).Таким образом, хотя расширенный SD позволяет большему количеству тРНК 3GC войти в комплекс 70S по стандартному пути 30S режима инициации (как показано выше), также возможно, что инициация рибосомами 70S увеличилась. Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали инициирующую активность в присутствии касугамицина, который ингибирует канонический процесс инициации 30S, но менее эффективен против инициации 70S (16, 21, 22). Таким образом, если бы трансляция мРНК репортера CAT с помощью тРНК 3GC имела преимущество режима инициации 70S, то при добавлении касугамицина в культуру его трансляция по сравнению с остальными клеточными мРНК подверглась меньшему влиянию, что привело бы к относительному увеличению КОТ.Как показано на фиг.6 A , по сравнению с необработанными клетками, хотя не было значительного изменения активности CAT на фоне SD wt (фиг.6 A , i ), наблюдалось увеличение в активности CAT на фоне SD a7g (фиг. 6 A , ii ) в результате инициации тРНК 3GC. Кроме того, учитывая, что присутствие канамицина (общего ингибитора синтеза белка) в этих условиях фактически привело к небольшому снижению активности CAT (как на фоне SD wt , так и SD a7g , рис.6 A ), усиливающий эффект касугамицина на фоне SD a7g является значительным. Такой эффект касугамицина не наблюдался для инициации тРНК fMet (антикодон CUA), обладающей последовательностью дикого типа в стволе антикодона (фиг. S3 A ). Эти наблюдения показывают, что для инициации с мРНК SD a7g , в частности, с помощью тРНК 3GC, по крайней мере частично, использовался режим инициации 70S.

Рис. 6.

Влияние SD a7g на инициацию 70S рибосомой.( A ) Инициирование тРНК 3GC в контексте SD wt ( i ) и SD a7g ( ii ) репортера CAT am1 при лечении касугамицином или канамицином. Культуры с OD 600 0,5, были разделены на три части, и активность CAT определялась в разное время из необработанных контролей или после обработки касугамицином (500 мкг / мл) или канамицином (25 мкг / мл). Эксперимент проводили для трех биологических повторов для каждой конструкции.Показаны кратные различия в активности CAT по сравнению с необработанным контролем во время разделения исходной культуры на три. Для справки, средняя активность CAT для тРНК 3GC в контексте SD wt и SD a7g в необработанном KL16 составляла 92,9 ± 4,0 и 2225,1 ± 656,3 пмоль Ac-Cm, продуцированных на мкг общего белка, соответственно. ( B и C ) Анализы активности в MG1655 (RRF wt ) и MG1655 frr ts (RRF ts ) в контексте SD wt и SD a7g CAT10 репортеры.Культуры выращивали до OD 600 0,5 при 30 ° C, а затем либо хранили при 42 ° C ( B ), либо обрабатывали 500 мкг / мл касугамицина ( C ) и инкубировали в течение 2 часов перед определением CAT. Показаны кратные различия в активности CAT по отношению к 3GC в MG1655 (6,2 ± 2,2 пмоль Ac-Cm, продуцируемого на мкг общего белка).

В еще одном подходе мы проанализировали инициирующую активность в штамме (MG1655 frr ts ), чувствительном к температуре (ts) из-за мутации фактора рециклинга рибосом (RRF), важного фактора, который расщепляет рибосомы 70S на 30S. и 50S субъединицы (23, 24).Известно, что дефицит активности RRF увеличивает уровень пустых комплексов 70S и, таким образом, усиливает режим инициации 70S (23). В штамме MG1655 frr ts усиление инициации с помощью тРНК 3GC для конструкции SD a7g (по сравнению с конструкцией SD wt ) как в разрешающей форме (рис. 6 B , сравните столбец 3 с 4) и недопустимых температур (рис.6 B , сравните столбцы 7 с 8), были выше, чем у штамма дикого типа для RRF (рис.6 B , столбцы 1 и 2 и 5 и 6 соответственно). Кроме того, несмотря на общее снижение трансляции при 42 ° C, увеличение для конструкции SD a7g было еще выше в штамме frr ts (фиг. 6 B , сравните столбцы 6 и 8), поддержка возможности инициирования режима 70S в расширенном контексте SD.

Чтобы проверить комбинированный эффект лечения RRF ts и касугамицина, штамм MG1655 frr ts обрабатывали касугамицином при 30 ° C.В этом эксперименте также увеличение инициирования 3GC было выше для конструкции SD a7g , чем для конструкции SD wt (фиг.6 C , сравните столбцы 2 с 4; и 1 с 3), и оно увеличилось. далее после обработки касугамицином на фоне RRF ts (сравните столбцы 2 с 6 и 4 с 8), тогда как он не оказал никакого эффекта в контексте SD wt (сравните столбцы 1 с 5 и 3 с 7). Учитывая, что на фоне RRF ts уровень RRF ниже даже при разрешающей температуре, и он накапливает более высокий уровень рибосом 70S (23), эти наблюдения дополнительно подтверждают, что тРНК 3GC использовала режим инициации 70S.

Влияние факторов инициирования.

Факторы инициации IF1, IF2 и IF3 участвуют в отборе тРНК fMet в P-сайте (7, 25, 26). Чтобы исследовать влияние различных факторов инициации, мы сверхэкспрессировали их из их плазмидных копий. Для справки, инициирующие активности pCAT am1 metY CUA были приняты за 100% (индивидуально для каждого штамма). Все остальные виды деятельности были представлены относительно этой деятельности.Как показано на фиг.7 A , инициирующая активность от pCAT am1 metY CUA / 3GC (3GC тРНК) в контексте SD wt или SD a7g оставалась почти неизменной при сверхэкспрессии IF1. (сравните блоки активности IF1, столбцы 5–8, с блоками вектора, столбцы 1–4). Интересно, что сверхэкспрессия IF2 вызвала значительное увеличение инициации от pCAT am1 metY CUA / 3GC в контексте SD a7g (рис.7 A , сравните столбцы 2 и 10), но не в контексте SD wt (столбцы 1 и 9). Тот факт, что IF2 функционирует как фактор ассоциации между 30S и 50S и управляет реакцией с образованием 70S, это наблюдение дополнительно подтверждает точку зрения, что инициация с помощью тРНК 3GC использовала 70S рибосомы.

Рис. 7.

Влияние факторов инициации на инициацию с помощью тРНК 3GC. ( A ) Инициирование тРНК CAT am1 , содержащих SD wt или SD a7g , посредством 3GC или тРНК fMet ( metY CUA ) тРНК при сверхэкспрессии IF1 (pACDH ) pACDH infB ), IF3 (pACDH infC ) или векторный контроль (pACDH, V).Активности CAT показаны со ссылкой на metY CUA (SD wt ), который был установлен как 100% индивидуально для каждого штамма. Для справки, активности CAT для metY CUA тРНК в контексте SD wt составляли 6619,2 ± 989,1, 14459,3 ± 1892,4, 29456,6 ± 1760,1 и 7521,2 ± 2312,5 пмоль Ac-Cm, продуцированного на мкг общего белка для штаммов, несущих векторный контроль (V), конструкции со сверхэкспрессией IF1, IF2 или IF3 соответственно. ( B ) Влияние нарушения активности IF3 на инициирование тРНК 3GC.Анализы CAT в KL16 ( infC ) или infC135 . Активности CAT (%) по отношению к metY CUA в SD wt для каждого штамма, как показано. Для справки, 100% активности CAT для metY CUA (SD wt ) в infC и infC 135 составляли 5236,4 ± 1204,5 и 13054,9 ± 2409,3 пмоль Ac-Cm, продуцированных на мкг общего белка, соответственно.

Сверхэкспрессия IF3 имела небольшой отрицательный эффект (27) на активность pCAT am1 metY CUA / 3GC в контексте SD wt (рис.7 A , сравните столбцы 1 и 13), но это не повлияло на контекст SD a7g (сравните столбцы 2 и 14). Однако мы наблюдали, что нарушение функции IF3 на фоне infC135 привело к повышенной активности pCAT am1 metY CUA / 3GC в конструкции SD a7g (фиг.7 B , сравните infC дикого типа. с infC135 , столбцы 2 и 6), но кратность увеличения меньше, чем у SD wt (рис.7 B , столбцы 1 и 5).

Обсуждение

Характеристика изолята E. coli , B21, в этом исследовании выявила, что мутация в одном из генов рРНК ( rrsC ), соответствующая изменению C на U в положении 1536 зрелого 16S. рРНК, приводящая к расширенному взаимодействию с SD-последовательностью репортерной мРНК, позволяла инициировать возникновение тРНК fMet , дефицитной по высококонсервативному признаку трех последовательных пар оснований GC в ее антикодонной основе.Это наблюдение было дополнительно подтверждено путем создания направленной мутации в последовательности SD репортерной мРНК для расширения ее взаимодействия с последовательностью aSD в 16S рРНК дикого типа. В отличие от повышенной инициации тРНК 3GC, расширенное взаимодействие SD: aSD было субоптимальным для инициации тРНК дикого типа fMet . Субоптимальная инициация тРНК fMet дикого типа может быть следствием снижения эффективности клиренса рибосом из области инициации трансляции мРНК (14).

Профилирование полисом и северный анализ фракций показали, что связывание тРНК 3GC с субъединицей 30S не является лимитирующим этапом для ее участия в инициации. Таким образом, неудивительно, что сверхэкспрессия мРНК CAT am1 (фиг. 2 D ) не устраняет дефект инициации тРНК 3GC. Однако по сравнению с тРНК fMet встречаемость тРНК 3GC во фракциях 70S была очень низкой (рис. 4), предполагая, что во время перехода преинициативного комплекса 30S в комплекс 70S, тРНК 3GC отвергалась.Это наблюдение предполагает, что пары оснований 3GC играют важную роль в стабилизации тРНК fMet во время перехода комплекса преиницииции 30S в комплекс 70S (фиг. 8, , A ). У дрожжей тРНК 3GC также показали стабильное связывание с рибосомами 40S (28, 29), но не с рибосомами 80S (28), что подтверждает наше предположение о роли пар 3GC, особенности тРНК инициатора, консервативных во всех сферах жизни. Исследования in vitro с использованием 70S рибосом также показали, что пары 3GC необходимы для связывания тРНК fMet с рибосомой (4).

Рис. 8.

Роль пар оснований 3GC в инициации трансляции. ( A ) Инициация трансляции начинается со связывания тРНК инициатора и факторов инициации IF1 (1), IF2 (2) и IF3 (3) с субъединицей 30S с образованием комплекса инициации 30S (30S IC) с последующим связыванием субъединица 50S, приводящая к комплексу 70S с тРНК fMet , связанной в состоянии P / I (показано наклоненной тРНК инициатора). Движение без сцепления, которому способствует гидролиз GTP в IF2 вместе с высвобождением факторов инициатора, переводит тРНК в классическое состояние ( i ).Наши результаты предполагают, что пары оснований 3GC в антикодонной основе тРНК инициатора играют основную роль в его удерживании на рибосоме во время этих переходов, чтобы генерировать компетентный к элонгации 70S комплекс. Начальное связывание тРНК fMet с субъединицей 30S не зависит от пар оснований 3GC. Присутствие расширенного SD в мРНК частично компенсирует это критическое требование. В отсутствие пар 3GC в тРНК инициатора или удлиненного SD в мРНК комплекс 70S разлагается ( ii ).( B ) Расширенная SD может также позволить обход требования базовой пары 3GC с помощью режима инициации 70S.

Как расширенный SD: aSD позволяет инициировать с помощью тРНК 3GC? Используя исследования одиночных молекул, было показано, что взаимодействие SD: aSD стабилизирует 70S, и для разделения субъединиц требуется больше энергии (30). Наличие расширенного SD позволяет большему количеству 3GC тРНК входить в комплекс 70S (рис. 5), указывая тем самым, что более стабильный комплекс 70S может компенсировать энергию связывания, вносимую парами оснований 3GC.Спираль SD: aSD, содержащая нуклеотиды 1534–1540 в 16S рРНК, взаимодействует с h38 (образует шейку 30S), h33a (образует платформу 30S) и h36. Используя трансляционный винт либрации (TLS), анализ структуры комплекса 70S, содержащего последовательность SD, с последовательностями, не имеющими ее, позволил предположить, что присутствие спирали SD: aSD снижает подвижность головки и платформы (31). Таким образом, позиционирование спирали SD: aSD может фиксировать ориентацию подвижной головки субъединицы 30S для оптимального взаимодействия с тРНК fMet в сайте 30S P.Было также показано, что по сравнению с вакантной рибосомой 70S, h36 и h38 раздвигаются на> 2 Å, вмещая спираль SD: aSD (31). Такое смещение около шарнира шеи приводит к изменению положения G1338 и A1339 в области головы на ~ 13 Å. Это изменение может позволить аккомодацию тРНК 3GC в 70S и привести к инициации. Интересно, что в другой кристаллической структуре, в которой использовалась расширенная SD в мРНК, взаимодействие G1338 и A1339 с парой оснований 3GC инициаторной тРНК оказалось неоптимальным (5).Это наблюдение предполагает, что дискриминационная роль пар 3GC уменьшается в контексте расширенного взаимодействия SD: aSD.

IF3 давно предлагается для тщательного изучения пар оснований 3GC (6, 26, 32). Однако это исследование может быть косвенным и согласовываться через G1338- и A1339-опосредованные A-минорные взаимодействия (6). В наших исследованиях сверхэкспрессия IF3 приводила к небольшому снижению инициации с помощью тРНК 3GC в контексте SD wt , тогда как в контексте SD a7g она не влияла (рис.7 А ). Однако неэффективно функционирующий IF3 ( infC135 ) привел к 6-8-кратному увеличению инициации с помощью тРНК 3GC в контексте SD wt и к 2-3-кратному увеличению в контексте SD a7g (рис.7 B ). Снижение действия IF3 за счет присутствия последовательности SD также наблюдалось в контексте повторной инициации рибосомами 70S (33). Эти наблюдения дополнительно подтверждают точку зрения, что смещение G1338 и A1339 (за счет расширенного взаимодействия SD) может смягчать опосредованное IF3 исследование последовательности 3GC.

Лечение касугамицином привело к усилению инициации с помощью тРНК 3GC в контексте SD a7g , что указывает на возможность инициации в режиме 70S, который относительно нечувствителен к касугамицину (то есть по сравнению с режимом 30S). Снижение RRF (RRF ts ), а также комбинирование фона RRF ts с обработкой касугамицином дополнительно поддерживало режим инициации 70S с расширенным SD. Режим инициации 70S является преобладающим способом инициации в безлидерных мРНК.Важно отметить, что присутствие инициаторной тРНК необходимо для образования комплекса 70S на безлидерных мРНК (34). Также было показано, что обработанный касугамицином комплекс 70S имел доступ для связывания с последовательностями SD (23). Взятые вместе, эти наблюдения подтверждают, что ведущие мРНК с сильными последовательностями SD могут (наоборот) способствовать инициации с помощью тРНК, лишенных пар 3GC. Кроме того, режим инициирования 70S оказался чувствительным к температуре (17). В соответствии с этим наблюдением мы отметили, что в штамме дикого типа для RRF повышение температуры роста приводило к снижению инициации из конструкции SD a7g тРНК 3GC (рис.6 B , сравните столбец 2 со столбцом 6; см. также рис. S3 B ). Хотя сообщалось о максимальном спаривании 12 или 13 нуклеотидов в спирали SD: aSD (35), большинство мРНК состоят из взаимодействий SD длиной от 4 до 6 оснований (36). Наиболее оптимальное взаимодействие SD: aSD в E. coli (при 37 ° C) имеет длину 6 нуклеотидов, при этом более короткие взаимодействия являются оптимальными при низких температурах (36).

IF2 действует как фактор ассоциации и помогает стыковать субъединицу 50S с комплексом предварительной инициации 30S.Сверхэкспрессия IF2 оказывает синергетический эффект на инициацию с помощью тРНК 3GC в расширенном контексте SD, скорее всего, за счет увеличения популяции 70S рибосом. Было также показано, что сверхэкспрессия IF2 увеличивает режим инициации 70S в бицистронных конструкциях (33). Таким образом, условия, благоприятствующие образованию 70S, также приводят к усилению инициации с помощью тРНК 3GC, особенно в контексте расширенного SD. Фактически, в классических экспериментах in vitro, предназначенных для расшифровки генетического кода (37), инициация происходила даже с элонгаторными тРНК за счет увеличения концентрации соли для стабилизации комплекса 70S, что еще раз указывает на то, что способ инициации 70S может обходиться без требования Пары 3GC в тРНК.

Таким образом, наши результаты предполагают, что пары 3GC в антикодоновой ножке инициаторной тРНК играют основную роль в ее удерживании на рибосоме во время переходов, чтобы генерировать компетентный к элонгации 70S комплекс (Рис. 8 A , i ). Присутствие расширенной SD в мРНК частично компенсирует это критическое требование, возможно, за счет стабилизации комплекса 70S во время этих переходов и предотвращения отторжения тРНК 3GC. В отсутствие пар 3GC в тРНК инициатора и удлиненного SD комплексы 70S распадаются и не переходят на стадию элонгации (рис.8 A , ii ). Текущее исследование также предполагает, что для режима инициирования 70S, который может устранить переходные изменения, необходимые во время режима инициирования 30S, потребность в парах 3GC не является жизненно важной (рис. 8 B ). Важно отметить, что хотя два механизма (рис.8 A и B ) не исключают друг друга, они оба подтверждают, что пары 3GC играют критическую роль в удержании тРНК fMet в рибосоме во время конформационных изменений, которые отмечают переход. преинициационного комплекса 30S в комплекс 70S.

Наконец, инициация рибосомами 70S с помощью тРНК, лишенных пар 3GC, может иметь значение с эволюционной точки зрения. Поскольку этот способ инициации не обязательно требует пар оснований 3GC, примитивный тип инициации мог быть осуществим исключительно с помощью элонгаторных тРНК. Процесс инициации должен развиваться после процесса элонгации, чтобы направить синтез белка из определенной точки в мРНК с коэволюцией пар 3GC в тРНК и последующей специализацией для инициации с помощью 30S рибосом.Интересно, что некоторые виды примитивных бактерий, такие как микоплазмы, альфа-протеобактерии, а также митохондрии дрожжей, не имеют полного набора пар 3GC в инициаторных тРНК.

Материалы и методы

Штаммы и плазмиды.

Штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S1. E. coli KL16 и его производные выращивали в чашках с LB и LB-агаром (Difco). Если не указано иное, в среду добавляли ампициллин (Amp, 100 мкг / мл), хлорамфеникол (Cm, 30 мкг / мл), канамицин (Kan, 25 мкг / мл) или тетрациклин (Tet, 7.5 мкг / мл).

Выделение, характеристика и генетическое картирование B21.

Выделение и предварительная характеристика E. coli B21 были описаны (9). Картирование супрессорной мутации проводили методами, описанными в ссылке. 9.

Сайт-направленный мутагенез.

Плазмиду pCAT am1 metY CUA / 3GC использовали в качестве матрицы для модификации вышестоящего репортера CAT am1 . Используя олигомеры с желаемой мутацией, проводили обратную ПЦР, продукт амплификации расщепляли DpnI и трансформировали в E.coli TG1, и желаемые мутанты были подтверждены секвенированием ДНК. Подробная информация о праймерах представлена ​​в таблице S2.

Профилирование полисомов.

Все препараты рибосом из E. coli проводили, как описано (15) с небольшими изменениями. Трансляция ингибировалась 0,3 мкМ тетрациклина перед сбором клеток и охлаждением на смеси льда и соли. Буфер 1 содержал 10% сахарозы. Приблизительно 10-20 OD 260 общей РНК использовали для анализа профиля на 20-40% (вес / объем) (15-35% в некоторых случаях) градиентах сахарозы (забуференных 20 мМ Hepes-KOH, pH 7.5, 50 мМ NH 4 Cl, 10 мМ MgCl 2 , 4 мМ β-меркаптоэтанол) получали с использованием градиентного мастера BioComp (BioComp Instruments) в полиядерных пробирках (SETON, каталожный № 7022). Образцы загружали на градиент и вращали в ультрацентрифуге с использованием ротора SW55 при 45 000 об / мин в течение 2–3 ч при 4 ° C, как описано в подписях к рисункам. Градиенты фракционировали с использованием фракционирующего устройства BioComp Gradient Fractionator со скоростью потока 0,3 мм в секунду. Субъединицы либо собирали вручную, следя за кривой поглощения при 254 нм с использованием монитора BIO-RAD Econo UV, либо равные фракции объемом 200–300 мкл собирали с использованием коллектора фракций (BIO RAD Model 2110 Fraction Collector).

Анализ РНК

.

Анализ фракций на наличие мРНК и тРНК методом дот-блоттинга проводили, как и ранее (15). Для анализа с использованием нативного геля РНК из полисомных фракций экстрагировали горячим фенолом, осаждали этанолом и разделяли на нативном ПААГ, переносили на мембрану Nytran. Мембраны зондировали на 16S рРНК, тРНК дикого типа fMet и 3GC тРНК, если это необходимо.

Приготовление бесклеточных экстрактов и анализы CAT.

Фаза среднего логарифма выросла на E.coli использовали для приготовления экстракта, как описано (9, 38).

Благодарности

Мы благодарим наших коллег из лаборатории за их предложения по рукописи. Эта работа была поддержана Департаментом науки и технологий (DST) и Департаментом биотехнологии. Ю.В. является научным сотрудником J. C. Bose по DST. S.S. поддерживается старшим научным сотрудником Shyama Prasad Mukherjee Совета научных и промышленных исследований.

Сноски

  • Автор: С.С. и Ю.В. спланированное исследование; S.S., H.N., R.A.S., S.A. и G.D. проводили исследования; С.С. и Ю.В. проанализированные данные; и С.С. и У.В. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1411637111/-/DCSupplemental.

Дозировка Advantage II для кошек

Сводка

Advantage II для кошек представлен в трех продуктах, каждый из которых соответствует определенному диапазону веса.Есть один для котят (от 2 до 5 фунтов), маленьких кошек (от 5 до 9 фунтов) и больших кошек (более 9 фунтов). Дозировка выше для более тяжелых кошек. См. Таблицу дозировки по весу ниже. Концентрация активного ингредиента одинакова во всех трех продуктах. См. Полную информацию о применении на этикетке продукта.

Детали

Advantage II для кошек
Дозировка по весу

Вес кошки Ежемесячная доза
от 2 до 5 фунтов 0.23 мл (0,0078 жидких унций)
от 5 до 9 фунтов 0,4 мл (0,014 жидкой унции)
более 9 фунтов 0,8 мл (0,027 жидкой унции)

Advantage II for Cats
Таблица с информацией о продукте

Возраст кошки 8 недель и старше
Вес кошки см. Диаграмму выше
Ежемесячная доза см. Диаграмму выше
Убивает имаго, яйца и личинки
Продолжительность дозы 30 дней
Состав 9.1% имидаклоприд
0,46% пирипроксифен
90,44% прочие ингредиенты
Этикетка продукта вид
Паспорт безопасности материала вид
Магазин Amazon

Примените правильную дозировку

Advantage II капли от блох специально разработаны и протестированы для кошек определенного веса. Полную дозу правильного продукта необходимо вводить ежемесячно. Изделие может выйти из строя, если не следовать инструкциям производителя.Владельцы нередко занижают дозу для своих питомцев из-за разделения лечения между животными. Проблемы токсичности также могут привести к недостаточной дозировке.

Повторное дозирование Раннее

Не применяйте более одной тюбика за один сеанс. В нормальных условиях одной дозы хватит на месяц. Однако при сильном заражении может потребоваться более раннее отступление кошки, чтобы установить контроль. Для котят (2–5 фунтов) повторное лечение не следует проводить чаще, чем раз в 14 дней.Маленьким кошкам (5–9 фунтов) и крупным кошкам (более 9 фунтов) не отступайте чаще одного раза в 7 дней. Как только контроль над блохами будет достигнут, следует придерживаться ежемесячного графика повторной обработки.

Список литературы

1543244 {6WCZDJ3I}; {RCKS2P2F}; {FQK2W4P4}; {2EHUIWES}; {44QVDVF7} природа дефолт ASC нет 14126 https://fleascience.com/wp-content/plugins/zotpress/

экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, улучшили основные симптомы генетически модифицированной мышиной модели аутизма Shank3B | Молекулярный аутизм

Уход за животными

Мышей содержали в соответствии с рекомендациями Федерации ассоциаций лабораторных животных (FELASA).Всех мышей разводили и содержали в виварии при 22 ° C в 12-часовом цикле свет / темнота, с пищей и водой, доступными ad libitum. Линия Shank3B KO была приобретена в Jackson Laboratories. Shank3B KO и однопометных мышей дикого типа были получены путем скрещивания гетерозиготных самцов и самок. Генетический фон для линий мышей Shank3B — C57BL / 6J. Эксперименты проводились на самцах мышей в возрасте 8-10 недель. Все протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Бар-Илан.

Генотипирование

Для определения генотипов Shank3B , ДНК была извлечена из образцов ушей, надрезанных во время отъема, с использованием набора для генотипирования мышей KAPA. Для определения генотипа мышей Shank3B использовали следующие праймеры: общий Fw 5′-GAGCTCTACTCCCTTAGGACTT-3 ‘; Rv мутантный 5’-TCAGGGTTATTGTCTCATGAGC-3 ‘(~ 330 п.н.) и для дикого типа: Rv 5′-TCCCCCTTTCACTGGACACCC-3’ (~ 250 п.н.).

Поведенческие тесты

Тест реципрокного диадического социального взаимодействия

Тест реципрокного диадического социального взаимодействия проводился, как описано ранее [9, 14].Перед тестом каждую мышь отделяли на 1-2 часа социальной изоляции. В качестве социального стимула использовали самца белой незнакомой мыши RCF в возрасте пяти недель. И незнакомца, и испытуемую мышь поместили в клетку размером 40 × 40 × 20 см. Во время взаимодействия мышей регистрировали в течение 20 минут, причем последние 10 минут количественно определял наблюдатель, слепой к лечению. Программное обеспечение Cowlog V3 использовалось для оценки социального контакта, инициированного тестовой мышью (Университет Хельсинки, Хельсинки, Финляндия).

Трехкамерный тест на социальное взаимодействие

Тест проводился в неослепляющем ящике из плексигласа (60 × 40 см) с двумя перегородками, которые делят ящик на три камеры: левую, центральную и правую (20 × 40 см). .Мышь помещают в среднюю камеру для привыкания (5 мин), когда доступ в обе боковые камеры закрыт. Затем подопытной мыши позволяли исследовать всю арену (10 мин), где они свободно выбирали между взаимодействием с новой мышью в одной камере или пребыванием в пустой камере (социальный тест). По истечении 10 минут в пустую камеру вводят вторую незнакомую мышь, и тестовой мыши дают 10 минут свободно выбирать между взаимодействием с новой или знакомой мышью.

Ультразвуковая вокализация

Ультразвуковая вокализация проводилась, как описано ранее [10, 14].И Shank3B KO, и самцы WT встретили самок WT, все сексуально наивные. Перед тестом каждую мышь помещали в отдельные клетки для социальной изоляции на 12 ч, самку помещали в клетку самца. УФ-излучение регистрировалось в течение первых 5 минут встречи, чтобы предотвратить чрезвычайно сильное сексуальное возбуждение и брачное поведение. Самки находились в одной клетке, чтобы синхронизировать цикл течки, и встретили самцов в один и тот же день. УФ регистрировали с помощью записывающей программы Avisoft-RECORDER v. 4.2.21.В настройки входили частота дискретизации 250 кГц и формат 16 бит. Для генерации спектрограммы записи были перенесены в Avisoft-SASLab Pro версии 5.2.07, и было проведено быстрое преобразование Фурье (БПФ). Спектрограммы были созданы с длиной БПФ 256 точек и перекрытием временного окна 50% (100% кадр, окно FlatTop).

Препарат мезенхимальных стволовых клеток

МСК человека были приобретены у Lonza (кат.: PT-2501, Базель, Швейцария) и культивированы, как описано ранее [35].Перед сбором экзосом клетки культивировали в среде тромбоцитов без экзосом в течение 3 дней, а затем эту среду собирали.

Протокол очистки экзосом

Очистку экзосом проводили с использованием протокола дифференциального центрифугирования. Сначала кондиционированную среду центрифугировали 10 мин при 300 g. Супернатант собирали и центрифугировали 10 мин при 2000 g. И снова супернатант центрифугировали 30 мин при 10000 g. Супернатант фильтровали через 0.22 мкм и центрифугировали 70 мин при 100000 g. Осадок, содержащий экзосомы и белки, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем центрифугировали в течение 70 мин при 100000 × g . Осадок, содержащий очищенные экзосомы, ресуспендировали в 200 мкм стерилизованного PBS. МСК-экзо были охарактеризованы с использованием технологии Nanosight, ПЭМ и вестерн-блоттинга, как описано ранее [14,15,16, 41].

Протокол лечения in vivo

В возрасте 4 недель 10 самцов мышей Shank3B KO были обработаны в общей сложности 20 мкл MSC-exo в концентрации 10 7 частиц / мкл.Лечение проводилось, как описано ранее [14]. В общем, каждая мышь, получавшая Shank3B KO, получала 5 мкл экзосом путем интраназального введения в течение 4 дней через день (всего 8 дней лечения). Поведенческий эксперимент проводился через 3 недели после последнего сеанса лечения.

FACS-анализ экзосом

Для FACS-анализа экзосомы наносили на гранулы альдегид / сульфатного латекса диаметром 4 мкм. Пятьдесят микролитров экзосом инкубировали с 12,5 мкл альдегидных / сульфатных латексных шариков диаметром 4 мкм (каталожный № A37304, Invitrogen) в течение 15 минут при комнатной температуре.Добавляли семьсот микролитров стерильного PBS, затем смесь переносили при 4 ° C и осторожно встряхивали в течение ночи. После центрифугирования осадок блокировали инкубацией с 200 мкл 100 мМ глицина в течение 30 мин при комнатной температуре. Гранулы, покрытые экзосомами, промывали PBS и ресуспендировали в 100 мкл стерильного PBS. После этого гранулы инкубировали с CD63-APC (каталожный номер 130-118-078, Miltenyi biotec), CD81-APC (каталожный номер 130-119-787 Miltenyi biotec) или контрольным изотипом IgG1 (каталожный номер 130-113-434, Miltenyi biotec) флуоресцентные Abs в течение 15 мин на льду в темноте.Гранулы анализировали проточной цитометрией с использованием анализатора потока Gallios FACS (Beckman Coulter). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения Kaluza Analysis (Beckman Coulter).

Мечение экзосом

Экзосомы метили PKh36 (Sigma-Aldrich). PKh36 (2 мкл) в 500-мкл разбавителя затем добавляли к 50 мкл экзосом в PBS в течение 5 мин инкубации. Экзосомы суспендировали в 70 мл PBS и центрифугировали в течение 90 мин при 100000 × g при 4 ° C. Осадок суспендировали в 200 мкл PBS [15, 16].

Протеомный анализ MSC-exo

Образцы подвергали лизису и триптическому расщеплению в растворе с использованием метода S-Trap (от Protifi). Полученные пептиды анализировали с помощью жидкостной хроматографии с нанопотоком (nanoAcquity) в сочетании с масс-спектрометрией с высоким разрешением и высокой точностью масс (Q Exactive HF). Каждый образец анализировался в приборе отдельно в случайном порядке в режиме обнаружения, а обработка ДАННЫХ производилась с помощью MaxQuant v1.6.0.16. Поиск данных проводился с помощью поисковой системы Andromeda в базе данных протеома человека с добавлением общих лабораторных примесей белков и следующих модификаций: фиксированная модификация (карбамидометилирование цистеина) и переменные модификации (окисление метионина, дезамидирование аспарагина и глутамина и N-концевое ацетилирование белка). .Количественные сравнения рассчитывались с использованием Perseus v1.6.0.7. Попадания-ловушки были отфильтрованы. Полученные пептиды анализировали с помощью жидкостной хроматографии с нанопотоком (nanoAcquity) в сочетании с высокой точностью масс-спектрометрии с высоким разрешением (Q Exactive HF). Каждый образец анализировался на приборе отдельно в случайном порядке в режиме обнаружения. Необработанные данные обрабатывались с помощью MaxQuant v1.6.0.16. Поиск данных проводился с помощью поисковой системы Andromeda в базе данных протеома человека с добавлением общих лабораторных примесей белков и следующих модификаций: фиксированная модификация (карбамидометилирование цистеина) и переменные модификации (окисление метионина, дезамидирование аспарагина и глутамина и N-концевое ацетилирование белка). .Количественные сравнения рассчитывались с использованием Perseus v1.6.0.7. Попадания-ловушки были отфильтрованы. Онтология генов была выполнена с использованием пакета ToppGene Suite [42]. Представленные условия GO соответствовали значению p <0,05 при частоте ложного обнаружения (FDR) по Бенджамини – Йекутиели.

Ex vivo imaging

Для иммуноокрашивания самцы мышей Shank3B KO ( n = 2) получали интраназальное введение 5 мкл меченного PKh36 MSC-exo и были умерщвлены через 24 часа после введения. Мышей перфузировали и фиксировали PBS и 4% параформальдегидом (PFA).Мозг инкубировали в PFA в течение 24 часов, затем в 30% сахарозе в течение 48 часов и хранили при 4 ° C. Мозг замораживали в охлажденном 2-метилбутане (Sigma-Aldrich), хранили при 4 ° C и затем разрезали на срезы толщиной 10 мкм. Срезы инкубировали с блокирующим раствором (5% козьей / ослиной сыворотки, 1% BSA, 0,5% Triton X-100 в PBS) в течение 1 часа. После этого слайды инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичным антителом в блокирующем растворе (мышиные анти-CD11b, 1: 500, Abcam) и вторичными антителами в блокирующем растворе (козьи антимышиные антитела Alexa 488, 1: 500, Molecular Probes, Invitrogen. ) в течение 1–2 ч при комнатной температуре.Затем ядра контрастировали с DAPI (1: 500; Sigma-Aldrich). В конечном итоге срезы были закреплены флуоресцентным монтажным раствором (Fluoromount-G, Southern Biotech), покрыты покровным стеклом и запечатаны лаком для ногтей.

Вскрытие образца мозга

Образцы мозга Shank3B KO ( n = 5) и WT ( n = 5), обработанные MSC-exo и физиологическим раствором, были взяты у мышей, которые не подвергались никакому поведенческому тестированию, и оставлены при нормальном световом цикле (не обратном световом цикле).Весь мозг мыши удаляли примерно в 12:00 (световой цикл с 7:00 до 19:00) и помещали в матрицу мозга взрослой мыши (Zivic Industries, Питтсбург, США). Срезы головного мозга (bregma 2,8–1,42) были удалены, и области префронтальной коры были получены с использованием иглы для биопсии 13-го калибра (VGC, Нью-Дели, Индия). Мозжечок удален с помощью скальпеля. Образцы мозга замораживали сухим льдом и хранили при -80 ° C до извлечения мРНК.

РНК-анализ

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили на системе обнаружения ABI ViiA ™ 7 RealTime PCR в объеме 10 мкл, содержащем FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Базель, Швейцария) и праймеры (дополнительные Таблица 1) при концентрации 0.По 5 мкМ. Десять нанограмм кДНК были диспергированы в каждой лунке, и все образцы были протестированы в трех экземплярах. Программа ПЦР состоит из 15-минутной фазы активации при 95 ° C, за которой следуют 40 циклов при следующих температурах: 10 с при 94 °, 30 с при 60 °. Данные ПЦР в реальном времени были нормализованы по гену домашнего хозяйства HPRT.

Статистический анализ

Все поведенческие и молекулярные эксперименты были проанализированы с помощью GraphPad (Prism). УФ анализировали с помощью SASLab Pro (Avisoft). Односторонний дисперсионный анализ с последующей коррекцией Бонферрони использовался для тестов социального поведения и УФ-излучения.Расчет мощности для ПЦР в реальном времени был рассчитан с помощью онлайн-калькулятора (http://onlinestatbook.com/2/calculators/power_calc.html). Двустороннее значение мощности составило 0,985, что соответствовало требованиям для пяти образцов. Для анализа ПЦР в реальном времени использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим апостериорным методом Тьюки.

АСД-2 (АСД) 100мл (Дорогов А.А.) для иммуномодулятора ЖИВОТНЫХ и ЖИВОТНЫХ, онкология

Способ применения и дозировка:
Внутрь и снаружи в растворе воды, с пищей в соответствии с инструкцией по применению .

Показания к применению.
Для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, мочеполовой системы, кожных поражений, нарушений обмена веществ, для стимуляции деятельности центральной и вегетативной нервной системы сельскохозяйственных животных и собак, для повышения естественной резистентности у ослабленных животных. и болеют инфекционными и инвазивными заболеваниями домашней птицы, а также для стимулирования роста и развития молодняка сельскохозяйственных животных и домашней птицы.

Ветеринарное применение
Препарат АСД-2Ф назначают сельскохозяйственным животным (в том числе домашней птице) и собакам, с лечебно-профилактической целью при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, органов дыхания, мочеполовой системы, поражениях кожи, нарушениях обмена веществ, для стимуляции деятельность центральной и вегетативной нервной системы, повышение естественной резистентности у ослабленных и восстановленных после инфекционных и инвазивных заболеваний животных, а также для стимуляции роста и развития поросят, цыплят и увеличения яйценоскости цыплят.

Биологические свойства и порядок применения подробно описаны в инструкции.

Особые указания и меры личной профилактики
Применение препарата АСД фракция 2 не исключает использования других лекарственных средств.
Продукты убоя, молоко дойных животных, яйца птицы в период применения препарата используются без ограничений.

Порядок подачи заявки

Внутрь препарат АСД фракция 2 назначают с питьевой водой перед кормлением или в смеси с комбикормом при утреннем кормлении в дозах, указанных в таблице.

Вид животных, возраст Количество препарата на голову (мл) Количество воды (мл) или корма (г)
Лошади
3 года и старше 10-20 200-600
От 1 года до 3 лет 10-15 200-400
До 1 года 5 100
Коровы
3 года и старше 20-30 200-400
От 1 года до 3 лет 10-15 100-400
До 1 года 5-7 40–100
Овцы
Старше 1 года 2-5 40–100
Более 6 месяцев 1-3 20-80
До 6 месяцев 0.5-2 10-40
Свиньи
Старше 1 года 5-10 100-200
Более 6 месяцев 2-5 40–100
2-3 месяца 1-3 20-80
Собаки
с 10 месяцев 2 40
Цыплята, индейки, утки, гуси
Взрослый скот 35 100 л
Молодняк 0.1 мл / кг

Наружно, внутриматочно и интравагинально препарат применяют в виде 2-20% растворов, приготовленных в стерильном физиологическом растворе. Для приема внутрь возможен препарат в кипяченой воде.

Меры личной профилактики
При работе с АСД фракции 2 следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с ветеринарными препаратами.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *